Центр связывания белковой части миоглобина и гемоглобина с гемом находится
Гемоглобин (НЬ)– сложный олигомерный белок, состоящий из 4 протомеров двух типов (2α и 2β), включающих 574 аминокислотных остатка. Содержится в эритроцитах, на его долю приходится до 90% массы белков клетки. Гемоглобин обеспечивает перенос кислорода из легких в ткани и удаление диоксида углерода из тканей.
В мышцах внутриклеточный транспорт и кратковременное депонирование кислорода осуществляет другой белок – миоглобин (Mb). Он не является олигомером, так как состоит только из одной полипептидной цепи, конформация которой очень похожа на пространственную структуру β-цепи гемоглобина (рис. 1.20). Большую часть молекулы
Рис. 1.20. Структура миоглобина иβ-цепи гемоглобина
А– миоглобин; Б– β-цепь гемоглобина
Mb и протомеров Hb составляют 8 α-спиральных участков, образующих глобулу с гидрофобным углублением, в котором находится центр связывания с кислородом (активный центр).При этом полипептидные цепи миоглобина и протомеров гемоглобина идентичны всего на 20%.
Оба белка являются холопротеинами, простетическая группа – гем, который находится в активном центре и участвует во взаимодействии с кислородом (рис. 1.21). Гем(ферропротопорфирин) представляет собой органическое соединение с плоской молекулой, включающей 4 пиррольных цикла и ион железа Fe2+. Он является окрашенным соединением и придает красный цвет гемоглобину, эритроцитам (красные кровяные тельца) и крови.
Гем присоединяется к неполярным радикалам активного центра своими пиррольными циклами, а также к радикалу гистидина с помощью атома Fe. Пиррольные кольца гема расположены в одной плоскости, а ион Fe2+ в неоксигенированом состоянии Hb выступает над плоскостью на 0,6 А. При присоединении кислорода ион железа погружается в плоскость колец гема (рис. 1.22). В результате сдвигается и участок полипептидной цепи, нарушаются слабые связи в молекуле Hb и изменяется конформация всей глобулы. Таким образом, присоединение кислорода вызывает изменение пространственной структуры молекулы миоглобина или протомеров гемоглобина.
Рис. 1.21. Строение гемоглобина и гема
А– гемоглобин– сложный белок, олигомер, состоит из 2 α- и 2 β-субъединиц глобина, каждая имеет центр связывания, где располагается небелковая часть молекулы – гем. Он участвует в присоединении молекулы кислорода. Между протомерами образуется аллостерический центр для присоединения регуляторного лиганда гемоглобина 2,3-бисфосфоглицерата;
Б– гем– простетическая группа гемоглобина, миоглобина и других гемопротеинов. Связывается с глобином гидрофобными связями между пиррольными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. В центре молеку-
2+
лы расположен ион железа (Fe ), который образует 6 координационных связей: 4 – с атомами азота пиррольных колец гема, 1 – с азотом радикала гистидина цепей глобина, 1 – с молекулой кислорода. В присоединении О2к гему участвует еще один радикал гистидина цепи глобина
Рис. 1.22. Взаимодействие кислорода с гемом в миоглобине и гемоглобине
Молекула миоглобина может присоединять только 1 молекулу кислорода в свой активный центр:
Гемоглобин является олигомерным белком и имеет ряд особенностей функционирования, характерных для всех олигомерных белков. Молекула гемоглобина состоит из 4 протомеров и имеет 4 центра связывания О2 (активные центры). Гемоглобин может существовать как в свободной (дезоксигемоглобин), так и в оксигенированной форме, присоединяя до 4 молекул кислорода. Взаимодействие с кислородом 1-го протомера вызывает изменение его конформации, а также кооперативные конформационные изменения остальных протомеров (рис. 1.23, А). Сродство к кислороду возрастает, и присоединение О2 к активному центру 2-го протомера происходит легче, вызывая дальнейшую конформационную перестройку всей молекулы. В результате еще сильнее изменяется структура оставшихся протомеров и их активных центров, взаимодействие с О2 еще больше облегчается. В итоге 4-я молекула кислорода присоединяется к Hb примерно в 300 раз легче, чем 1-я (рис. 1.23, Б). Так происходит в легких при высоком парциальном давлении кислорода. В тканях, где содержание кислорода
ниже, наоборот, отщепление каждой молекулы О2 облегчает освобождение последующих.
Таким образом, взаимодействие олигомерного белка гемоглобина с лигандом (О2) в одном центре связывания приводит к изменению конформации всей молекулы и других, пространственно удаленных центров, расположенных на других субъединицах (принцип «домино»). Подобные взаимосвязанные изменения структуры белка называют кооперативными конформационными изменениями.Они характерны для всех олигомерных белков и используются для регуляции их активности.
Взаимодействие обоих белков (Mb и Hb) с кислородом зависит от его парциального давления в тканях. Эта зависимость имеет разный характер, что связано с их особенностями структуры и функционирования (рис. 1.24).
Гемоглобин имеет S-образную кривую насыщения, которая показывает, что субъединицы белка работают кооперативно, и чем больше кислорода они отдают, тем легче идет освобождение остальных молекул О2. Этот процесс зависит от изменения парциального давления кислорода в тканях.
График насыщения миоглобина кислородом имеет характер простой гиперболы, т.е. насыщение Mb кислородом происходит быстро и отражает его функцию – обратимое связывание с
Рис. 1.23. Кооперативные изменения конформации молекулы гемоглобина при взаимодействии с кислородом
А– при взаимодействии молекулы дезоксигемоглобина НЬ с О2 происходят кооперативные конформационные изменения, которые сопровождают присоединение каждой последующей молекулы кислорода; Б– в результате изменения конформации активного центра возрастает сродство НЬ к кислороду, 4-я молекула кислорода присоединяется к оксигенированному гемоглобину [НЬ(О2)3] в 300 раз легче, чем 1-я
Рис. 1.24. Кривые насыщения миоглобина и гемоглобина кислородом
кислородом, высвобождаемым гемоглобином, и освобождение в случае интенсивной физической нагрузки.
Изменение сродства гемоглобина к О2 обеспечивает быстрое насыщение крови кислородом в легких, а также освобождение и передачу его в ткани. Миоглобин обладает более высоким сродством к О2, поэтому связывает и передает в митохондрии клеток кислород, транспортируемый НЬ в мышцы.
Гемоглобин доставляет в сутки до 600 л (850 г) О2 в ткани и способствует удалению из них ~ 500 л (1000 г) СО2. Движущей силой этих потоков является градиент концентраций О2 между альвеолярным воздухом и межклеточной жидкостью. Парциальное давление О2 в альвеолярном воздухе составляет 100 мм рт.ст. Парциальное давление О2
в тканях намного ниже (~ 40 мм рт.ст.), что обусловлено поступлением и использованием кислорода митохондриями клеток, где он превращается в Н2О. Таким образом О2 поглощается клетками.
Обмен О2 и СО2 происходит в капиллярах: в легких О2 переходит из альвеолярного воздуха в эритроциты, а СО2 – в обратном направлении; в капиллярах тканей О2 из эритроцитов перемещается в клетки тканей, а СО2 – в обратном направлении (рис. 1.25).
Изменение функциональной активности белка при взаимодействии с другими лигандами вследствие конформационных изменений называется аллостерической регуляцией,а соединения-регуляторы –аллостерическими лигандами.Способность к аллостерической регуляции характерна, как правило, для олигомерных белков, т.е. для проявления аллостерического эффекта необходимо взаимодействие протомеров. При воздействии аллостерических лигандов белки меняют свою конформацию (в том числе и активного центра) и функцию.
Молекула гемоглобина способна связываться с несколькими лигандами: О2, Н+, СО2, 2,3-бис- фосфоглицератом (БФГ). Н+, СО2 и БФГ являются аллостерическими регуляторами активности гемоглобина и присоединяются к участкам (аллостерическим центрам), пространственно удаленным от активного центра.
Концентрация аллостерических лигандов снижает сродство гемоглобина к кислороду, а миоглобин и отдельные субъединицы гемоглобина нечувствительны к изменениям концентрации Н+, СО2 и БФГ, т.е. аллостерические свойства гемоглобина возникают только в результате взаимодействия субъединиц.
Рис. 1.25. Перенос кислорода и диоксида углерода гемоглобином. Эффект Бора
БФГ образуется из глюкозы в эритроцитах и является одним из регуляторов работы гемоглобина. Его молярная концентрация в крови близка к молярной концентрации НЬ. В центре молекулы гемоглобина полипептидные цепи 4 протомеров образуют полость (аллостерический центр), причем величина ее увеличивается в дезоксигемоглобине и уменьшается в оксигемоглобине. БФГ поступает в полость дезоксигемоглобина, связываясь с положительно заряженными группами на β-протомере (рис. 1.26). При этом его сродство к О2 снижается в 26 раз. В результате происходит высвобождение кислорода в капиллярах ткани при низком парциальном давлении О2.
Рис. 1.26. Связывание БФГ с дезоксигемоглобином
Центр связывания БФГ находится в положительно заряженной полости между 4 протомерами гемоглобина. Взаимодействие БФГ с центром связывания изменяет конформацию α- и β-протомеров НЬ и их активных центров. Сродство НЬ к молекулам О2 снижается и кислород высвобождается в ткани. В легких при высоком парциальном давлении О2 активные центры гемоглобина насыщаются за счет изменения конформации и БФГ вытесняется из аллостерического центра
В легких высокое парциальное давление О2, наоборот, приводит к оксигенированию НЬ и освобождению БФГ.
Содержание БФГ в крови человека соответствует содержанию гемоглобина и повышается при понижении содержания кислорода в воздухе (гипоксии) или затруднении дыхания при заболеваниях легких. Понижение его концентрации ухудшает снабжение тканей кислородом.
Это важно учитывать при переливании крови и сохранять необходимую концентрацию БФГ при консервации. Переливание донорской крови с пониженным содержанием БФГ может привести к гипоксии и гибели больных.
В регуляции работы гемоглобина основная роль принадлежит протонам Н+. • В тканиНЬ поступает преимущественно в виде НЬ(О2)4. Но при низком парциальном давлении О2 происходит отщепление части кислорода. Увеличение содержания не полностью оксигенированных форм НЬ облегчает высвобождение О2.
В мышцах образуется много СО2, который под действием карбоангидразы превращается в угольную кислоту Н2СО3, диссоциирующую на Н+ и бикарбонат-ион:
СО2 + Н2О → Н2СО3 → Н+ + НСО3-
Повышение концентрации Н+ вызывает протонирование ионогенных групп НЬ, что приводит к снижению его сродства к О2:
Н+ + НЬ О2 → Н+ НЬ + О2
Далее с дезоксигемоглобином взаимодействует
БФГ:
В легкиепоступает кровь с высоким содержанием дезоксигемоглобина, протонированного, связанного с БФГ или СО2. В такой форме гемоглобин имеет пониженное сродство к О2.
Из капилляров диффундирует СО2, освобождающийся в результате реакции:
Н+ + НСО-3 → Н2СО3 → СО2 + Н2О
Это стимулирует депротонирование гемоглобина:
Н+ НЬ → Н+ + НЬ
Высокое парциальное давление О2 приводит к оксигенированию НЬ, при этом вытесняется БФГ:
НЬ БФГ → НЬ + БФГ
Частичное оксигенирование гемоглобина повышает его сродство к кислороду, все реакции, приведенные выше, происходят в обратном порядке.
Зависимость сродства гемоглобина к кислороду от концентрации ионов водорода (Н+) получила названиеэффекта Борапо имени датского физиолога, изучавшего функционирование гемоглобина (см. рис. 1.25).
Таким образом, количество транспортируемого гемоглобином в ткани кислорода регулируется и повышается при увеличении содержания СО2 и Н+ в крови (например, при интенсивной физической работе); при сдвиге рН крови в щелочную сторону (алкалозе) доставка кислорода в ткани понижается.
Миоглобин (Мв) – белок, находящийся в красных мышцах, основная функция которого – создание запасов О2, необходимых при интенсивной мышечной работе. Мв – сложный белок, содержащий белковую часть – апоМв и небелковую часть – гем. Первичная структура апоМв определяет его компактную глобулярную конформацию и структуру активного центра, к которому присоединяется небелковая часть миоглобина – гем. Кислород, поступающий из крови в мышцы, связывается с Fe+2 гема в составе миоглобина. Мв – мономерный белок, имеющий очень высокое сродство к О2, поэтому отдача кислорода миоглобином происходит только при интенсивной мышечной работе, когда парциальное давление O2 резко снижается.
Формирование конформации Мв.В красных мышцах на рибосомах в ходе трансляции идет синтез первичной структуры Мв, представленной специфической последовательностью 153 аминокислотных остатков. Вторичная структура Мв содержит восемь α-спиралей, называемых латинскими буквами от А до Н, между которыми имеются неспирализованные участки. Третичная структура Мв имеет вид компактной глобулы, в углублении которой между F и Е α-спиралями расположен активный центр (рис. 1.19).
Рис. 1.19. Структура миоглобина
3. Особенности строения и функционирования активного центра Мв.Активный центр Мв сформирован преимущественно гидрофобными радикалами аминокислот, далеко отстоящими друг от друга в первичной структуре (например, Три39и Фен138) К активному центру присоединяется плохо растворимые в воде лиганды – гем и О2. Гем – специфический лиганд апоМв (рис. 1.20), основу которого составляют четыре пиррольных кольца, соединенных метенильными мостиками; в центре расположен атом Fe+2, соединенный с атомами азота пиррольных колец четырьмя координационными связями. В активном центре Мв кроме гидрофобных радикалов аминокислот имеются также остатки двух аминокислот с гидрофильными радикалами – Гис Е7(Гис64) и Гис F8(Гис93) (рис. 1.21).
Рис. 1.20. Строение гема – небелковой части миоглобина и гемоглобина
Рис. 1.21. Расположение гема и O2 в активном центре апомиоглобина и протомеров гемоглобина
Гем через атом железа ковалентно связан с Гис F8. O2 присоединяется к железу с другой стороны плоскости гема. Гис Е7необходим для правильной ориентации О2 и облегчает присоединение кислорода к Fe+2 гема
Гис F8образует координационную связь с Fe+2 и прочно фиксирует гем в активном центре. Гис Е7необходим для правильной ориентации в активном центре другого лиганда – O2 при его взаимодействии с Fe+2 гема. Микроокружение гема создает условия для прочного, но обратимого связывания O2 с Fe+2 и препятствует попаданию в гидрофобный активный центр воды, что может привести к его окислению в Fе+3.
Мономерное строение Мв и его активного центра определяет высокое сродство белка к О2.
4. Олигомерное строение Нв и регуляция сродства Нв к О2 лигандами. Гемоглобины человека– семейство белков, так же как и миоглобин относящиеся к сложным белкам (гемопротеинам). Они имеют тетрамерное строение и содержат две α-цепи, но различаются по строению двух других полипептидных цепей (2α-, 2х-цепи). Строение второй полипептидной цепи определяет особенности функционирования этих форм Нв. Около 98% гемоглобина эритроцитов взрослого человека составляет гемоглобин А(2α-, 2р-цепи).
В период внутриутробного развития функционируют два основных типа гемоглобинов: эмбриональный Нв(2α, 2ε), который обнаруживается на ранних этапах развития плода, и гемоглобин F (фетальный)– (2α, 2γ), который приходит на смену раннему гемоглобину плода на шестом месяце внутриутробного развития и только после рождения замещается на Нв А.
Нв А – белок, родственный миоглобину (Мв), содержится в эритроцитах взрослого человека. Строение его отдельных протомеров аналогично таковому у миоглобина. Вторичная и третичная структуры миоглобина и протомеров гемоглобина очень сходны, несмотря на то что в первичной структуре их полипептидных цепей идентичны только 24 аминокислотных остатка (вторичная структура протомеров гемоглобина, так же как миоглобин, содержит восемь α-спиралей, обозначаемых латинскими буквами от А до Н, а третичная структура имеет вид компактной глобулы). Но в отличие от миоглобина гемоглобин имеет олигомерное строение, состоит из четырех полипептидных цепей, соединенных нековалентными связями (рис 1.22).
Каждый протомер Нв связан с небелковой частью – гемом и соседними протомерами. Соединение белковой части Нв с гемом аналогично таковому у миоглобина: в активном центре белка гидрофобные части гема окружены гидрофобными радикалами аминокислот за исключением Гис F8 и Гис Е7, которые расположены по обе стороны от плоскости гема и играют аналогичную роль в функционировании белка и связывании его с кислородом (см. строение миоглобина).
Рис. 1.22. Олигомерная структура гемоглобина
Кроме того, Гис Е7выполняет важную дополнительную рольв функционировании Нв. Свободный гем имеет в 25 000 раз более высокое сродство к СО, чем к О2. СО в небольших количествах образуется в организме и, учитывая его высокое сродство к гему, он мог бы нарушать транспорт необходимого для жизни клеток О2. Однако в составе гемоглобина сродство гема к оксиду углерода превышает сродство к О2 всего в 200 раз благодаря наличию в активном центре Гис Е7. Остаток этой аминокислоты создает оптимальные условия для связывания гема с O2 и ослабляет взаимодействие гема с СО.
5. Основная функция Нв – транспорт О2 из легких в ткани.В отличие от мономерного миоглобина, имеющего очень высокое сродство к О2 и выполняющего функцию запасания кислорода в красных мышцах, олигомерная структура гемоглобина обеспечивает:
1) быстрое насыщение Нв кислородом в легких;
2) способность Нв отдавать кислород в тканях при относительно высоком парциальном давлении O2 (20-40 мм рт. ст.);
3) возможность регуляции сродства Нв к О2.
6. Кооперативные изменения конформации протомеров гемоглобина ускоряют связывание O2 в легких и отдачу его в ткани.В легких высокое парциальное давление O2 способствует связыванию его с Нв в активном центре четырех протомеров (2α и 2β). Активный центр каждого протомера, так же как и в миоглобине, расположен между двумя α-спиралями (F и Е) в гидрофобном кармане. Он содержит небелковую часть – гем, прикрепленный к белковой части множеством слабых гидрофобных взаимодействий и одной прочной связью между Fe2+ гема и Гис F8 (см. рис. 1.21).
В дезоксигемоглобине, благодаря этой связи с Гис F8, атом Fe2+ выступает из плоскости гема по направлению к гистидину. Связывание O2 с Fe2+ происходит по другую сторону гема в области Гис Е7 с помощью единственной свободной координационной связи. Гис Е7 обеспечивает оптимальные условия для связывания O2 с железом гема.
Присоединение O2 к атому Fe+2 одного протомера вызывает его перемещение в плоскость гема, а за ним и остатка гистидина, связанного с ним
(рис. 1.23).
Рис. 1.23. Изменение конформации протомера гемоглобина при соединении с O2
Это приводит к изменению конформации всех полипептидных цепей за счет их конформационной лабильности. Изменение конформации других цепей облегчает их взаимодействие со следующими молекулами О2.
Четвертая молекула О2 присоединяется к гемоглобину в 300 раз легче, чем первая (рис. 1.24).
Рис. 1.24. Кооперативные изменения конформации протомеров гемоглобина при его взаимодействии с О2
В тканях каждая следующая молекула O2 отщепляется легче, чем предыдущая, также за счет кооперативных изменений конформации протомеров.
7. CO2 и Н+, образующиеся при катаболизме органических веществ, уменьшают сродство гемоглобина к О2 пропорционально их концентрации.Энергия, необходимая для работы клеток, вырабатывается преимущественно в митохондриях при окислении органических веществ с использованием O2, доставляемого из легких гемоглобином. В результате окисления органических веществ образуются конечные продукты их распада: СО2 и K2O, количество которых пропорционально интенсивности протекающих процессов окисления.
СO2 диффузией попадает из клеток в кровь и проникает в эритроциты, где под действием фермента карбангидразы превращается в угольную кислоту. Эта слабая кислота диссоциирует на протон и бикарбонат ион.
Н+ способны присоединятся к радикалам Гис146в α- и β-цепях гемоглобина, т.е. в участках, удаленных от гема. Протонирование гемоглобина снижает его сродство к О2, способствует отщеплению О2 от оксиНв, образованию дезоксиНв и увеличивает поступление кислорода в ткани пропорционально количеству образовавшихся протонов (рис. 1.25).
Увеличение количества освобожденного кислорода в зависимости от увеличения концентрации Н+ в эритроцитах называется эффектом Бора(по имени датского физиолога Христиана Бора, впервые открывшего этот эффект).
В легких высокое парциальное давление кислорода способствует его связыванию с дезоксиНв, что уменьшает сродство белка к Н+. Освободившиеся протоны под действием карбангидразы взаимодействуют с бикарбонатами с образованием СО2 и Н2О
Рис. 1.25. Зависимость сродства Нв к О2 от концентрации СО2 и протонов (эффект Бора):
А– влияние концентрации СО2 и Н+ на высвобождение О2 из комплекса с Нв (эффект Бора); Б– оксигенирование дезоксигемоглобина в легких, образование и выделение СО2.
Образовавшийся СО2 поступает в альвеолярное пространство и удаляется с выдыхаемым воздухом. Таким образом, количество высвобождаемого гемоглобином кислорода в тканях регулируется продуктами катаболизма органических веществ: чем интенсивнее распад веществ, например при физических нагрузках, тем выше концентрация СО2 и Н+ и тем больше кислорода получают ткани в результате уменьшения сродства Нв к О2.
8. Аллостерическая регуляция сродства Нв к О2 лигандом – 2,3-бис- фосфоглицератом.В эритроцитах из продукта окисления глюкозы – 1,3-бисфосфоглицерата синтезируется аллостерический лиганд гемоглобина – 2,3-бисфосфоглицерат (2,3-БФГ). В нормальных условиях концентрация 2,3-БФГ высокая и сравнима с концентрацией Нв. 2,3-БФГ имеет сильный отрицательный заряд -5.
Бисфосфоглицерат в капиллярах тканей, связываясь с дезоксигемоглобином, увеличивает выход кислорода в ткани, уменьшая сродство Нв к О2.
В центре тетрамерной молекулы гемоглобина находится полость. Ее образуют аминокислотные остатки всех четырех протомеров (см. рис. 1.22). В капиллярах тканей протонирование Нв (эффект Бора) приводит к разрыву связи между железом гема и О2. В молекуле
дезоксигемоглобина по сравнению с оксигемоглобином возникают дополнительные ионные связи, соединяющие протомеры, вследствие чего размеры центральной полости по сравнению с оксигемоглобином увеличиваются. Центральная полость является местом присоединения 2,3-БФГ к гемоглобину. Из-за различия в размерах центральной полости 2,3-БФГ может присоединяться только к дезоксигемоглобину.
2,3-БФГ взаимодействует с гемоглобином в участке, удаленном от активных центров белка и относится к аллостерическим(регуляторным) лигандам, а центральная полость Нв является аллостерическим центром.2,3-БФГ имеет сильный отрицательный заряд и взаимодействует с пятью положительно заряженными группами двух β-цепей Нв: N-концевой α-аминогруппой Вал и радикалами Лиз82 Гис143 (рис. 1.26).
Рис. 1.26. БФГ в центральной полости дезоксигемоглобина
БФГ связывается с тремя положительно заряженными группами в каждой β-цепи.
В капиллярах тканей образующийся дезоксигемоглобин взаимодействует с 2,3-БФГ и между положительно заряженными радикалами β-цепей и отрицательно заряженным лигандом образуются ионные связи, которые изменяют конформацию белка и снижают сродство Нв к О2. Уменьшение сродства Нв к О2 способствует более эффективному выходу О2 в ткани.
В легких при высоком парциальном давлении кислород взаимодействует с Нв, присоединяясь к железу гема; при этом изменяется конформация белка, уменьшается центральная полость и происходит вытеснение 2,3-БФГ из аллостерического центра
Таким образом, олигомерные белки обладают новыми по сравнению с мономерными белками свойствами. Присоединение лигандов на участках,
пространственно удаленных друг от друга (аллостерических), способно вызывать конформационные изменения во всей белковой молекуле. Благодаря взаимодействию с регуляторными лигандами происходит изменение конформации и адаптация функции белковой молекулы к изменениям окружающей среды.