Гемоглобин гемихромный метод с калибратором

Руководитель Департамента государственного контроля

качества, эффективности, безопасности лекарственных

средств и медицинской техники МЗ РФ

Р.У. Хабриев

17.06.2000 г.

Рекомендована к утверждению

Комиссией по лабораторным реагентам

 Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 

(протокол № 1 от 31.01.2000 г.) 

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения

гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом

НАЗНАЧЕНИЕ 

Набор предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (метод Drabkin) в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. 

Набор рассчитан на проведение 600 определений при расходе 5,0 мл рабочего раствора на один анализ.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 (500–560) нм.

СОСТАВ НАБОРА

1. Трансформирующий реагент – сухая смесь (натрий углекислый кислый, 1,0 г; калий железосинеродистый, 200 мг) – 3 упаковки.

2. Ацетонциангидрин – 3 ампулы (по 0,5 мл).

3. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л – 1 флакон (2 мл).

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Линейная область определения концентрации гемоглобина – в диапазоне от 20 до 200 г/л, отклонение от линейности – не более 2%.

Чувствительность определения – не более 10 г/л.

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 2%.

Нормальные величины концентрации гемоглобина в крови составляют:

     – у мужчин 130–160 г/л;

     – у женщин 120–140 г/л.

Качество набора можно оценивать с использованием контрольных растворов гемоглобина отечественного или зарубежного производства. 

Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При работе с данным набором необходимо соблюдать правила техники безопасности, рекомендуемые при работе с кровью в соответствии с Инструкцией по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений, утвержденной Минздравом СССР от 17.01.91 г., и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР». 

 При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

В состав трансформирующего раствора входит ацетонциангидрин, ядовитое вещество. В случае попадания раствора на кожу и слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается. При попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. 

Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

 ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

– Спектрофотометр, длина волны 540 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 500–560 нм (зеленый светофильтр), кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

– пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02 и 5,0 мл;

– колба мерная вместимостью 1,0 л;

– пробирки вместимостью 5–10 мл;

– секундомер;

– вода дистиллированная;

– перчатки резиновые или пластиковые.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Трансформирующий раствор. Один пакет трансформирующего реагента и одну ампулу ацетонциангидрина количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1,0 л, растворить в небольшом количестве дистиллированной воды и довести объем дистиллированной водой до метки.

Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

В пробирки внести по 5,0 мл трансформирующего раствора, добавить по 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18–25° С) в течение 20 минут, после чего измерить величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. 

Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и пробу цельной крови.

Окраска устойчива в течение 1 часа.

Концентрацию гемоглобина в крови рассчитать по формуле:

              Eо

     С = ———  х 120 ,

              Eк

где: С – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

       Eо – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;

       Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

       120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 

Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение  наборов при температуре до +25° С не более 5 суток. 

Срок годности набора – 2 года.

Трансформирующий раствор должен  быть прозрачным, желтого цвета и может храниться в посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 6 месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден для употребления. Не замораживать!

Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона может храниться в течение 6 месяцев, но не более срока годности набора, при хранении в укупоренном виде при температуре +2–8° С.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок (495) 777-41-92.

Инструкция составлена:  к.б.н. И.В. Смирновым – ст.н.с. Гематологического научного центра РАМН, к.б.н. Н.Н. Контугановым, В.В. Майоровой – сотрудниками ООО «Агат–Мед».

УТВЕРЖДАЮ Руководитель Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ В.Е. Акимочкин 06.02.2002 г.

Рекомендована к утверждению Комиссией по лабораторным реагентам Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол № 6 от 03.07.2001 г.)

ИНСТРУКЦИЯ

по применению

Раствора гемоглобина калибровочного

НАЗНАЧЕНИЕ

Калибровочный раствор гемоглобина предназначен для калибровки количественного определения гемоглобина в крови человека унифицированным гемиглобинцианидным методом. Калибратор может быть использован также для калибровки других методов определения гемоглобина, основанных на принципе трансформирования, то есть на переводе всех форм гемоглобина в одну: пиридин-гемхромогеновый, гемихромный (под действием поверхностно-активных веществ), метод с образованием щелочного гематина D-575 и других.

Предназначен для использования в клинико-диагностических, гематологических и биохимических лабораториях.

СОСТАВ

Раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л с добавлением этиленгликоля 30 об%, 2,0 мл — 1 флакон.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Отклонение от аттестованной величины — не более 2%. Коэффициент вариации — не более 2%.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Потенциальный риск применения калибровочного раствора — класс 1.

Все компоненты калибровочного раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.

Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и опытные пробы, в соответствии с инструкцией (методикой) по проведению соответствующего метода определения. Концентрацию гемоглобина рассчитать по формуле:

где: С — концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

       Eо — оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;

       Eк — оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

       120 — концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ

Калибровочный раствор следует хранить в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение при температуре до +25° С не более 5 суток.

Срок годности — 2 года.

Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона можно хранить в плотно укупоренном виде при температуре +2–8° С в течение 6 месяцев, но не более указанного срока годности.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат—Мед». Телефон для справок: (495) 777-41-92.

Регистрационные удостоверения

Назад к списку инструкций

Суть гемихромного метода определения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Для упрощения подсчета его количества пигмент переводят в одну форму – гемихром (HbChr). Он имеет интенсивный красный цвет и длину волны 540 нм, поэтому подсчитывается легко. Его число отображает всю концентрацию Hb в исследуемой жидкости.

Для перевода гемоглобина в гемихром использует реагенты для трансформации:

• четвертичные аммониевые основания с ПАВ;
• соли жирных кислот с добавлением ЭДТА;
• SDS.

Выпускаются новые реагенты, в составе которых отсутствуют цианиды. Они основаны на додецилсульфате натрия.  Наилучшим веществом является SDS. Скорость перехода пигмента при его использовании намного выше, чем у других реактивов. Необходимо всего 5 минут. С помощью реагентов возможно использование исследования в качестве экспресс-метода. То есть возможно проведение множества анализов за 1 рабочий день. При этом пациент получает на руки готовый результат в день сдачи биологической жидкости.

В лабораториях часто используют исследования гемоглобина гемихромным методом с помощью реактивов Ольвекс. Он содержит натрия лаурилсульфат, полностью безопасный для врачей. Его достоинством является низкая стоимость при высоком качестве и продолжительном сроке годности.

Материалом для исследования является капиллярная или венозная кровь. Последний вариант используется чаще, так как исследование более достоверно. Узнайте, чем отличается анализ крови из пальца и вены.

В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, например, ЭДТА или гепарин. Это предотвратит образование сгустка.

Исследование проводят в несколько этапов.

• В биологическую жидкость добавляют трансформирующий раствор в соотношении 20:5000 мкл. Полученный образец тщательно перемешивают. Возможно использование центрифуги. Жидкость должна тщательно перемешаться. Реагент воздействует на кровь в течение 5 минут.
• Для определения концентрации гемоглобина используют фотометр. Это оптический прибор, который подсчитывает показатель при длине волны 540 нанометров.
• Результат, полученный с помощью полуавтоматического анализатора, подставляют в формулу C =A×f, где C – концентрация гемоглобина; A – данные, полученные на фотометре; f – фактор, индивидуальный для каждого фотометра.

Полученные данные записывают на бланке исследования, передают пациенту. Он может самостоятельно сравнить результат с нормой. Но для постановки диагноза необходимо обратиться к врачу. Он выявит отклонения, назначит лечение.

На бланке исследования записывается полученные результаты, которые можно сравнить с нормой. Она разнится по возрасту и полу. Данные описаны в таблице.

Незначительное отклонение показателя не свидетельствует о появлении заболевания. Отклонение от нормы в меньшую или большую степень на несколько единиц должно быть проверено повторным исследованием. Если результат тот же, врач должен выявить причину состоянии, назначить лечение.

Плюсы гемихромного метода определения гемоглобина

Методика определения Hb с помощью гемихромного метода имеет множество положительных сторон:

• два варианта сдачи крови: забор капиллярной или венозной жидкости;
• экспресс-диагностика, которая позволяет получить результат в день сдачи исследования;
• безопасность для сотрудников лаборатории, так как методика не использует токсические реактивы, которые могут навредить здоровью;
• использование полуавтоматического анализатора, который полностью устраняет риск врачебной ошибки на этапе подсчета клеток;
• простота метода, использование дешевых реактивов, которые экономят деньги клинического учреждения;
• точность полученных показателей, благодаря которым лечащий врач определяет состояние пациента, назначает дополнительные методы диагностики и лечение;
• необходимость использования малого количества крови для анализа, если лаборант решил, что анализ недостоверной, возможно повторное тестирование;
• использование незначительного количества реактивов для одного исследования, что позволяет распределить химические вещества на множество тестирований;
• дешевизна одного реактива, что позволяет клинике закупить множество данных химических веществ.

Минусы гемихромного метода определения гемоглобина

Методика имеет отрицательные стороны, которые учитываются врачом в постановке диагноза:

• возможность врачебной ошибки на этапе сдачи крови;
• возможность неправильного приготовления реактива, использование неверных концентрации для разведения крови;
• отсутствие возможности рассмотреть форму и размер клеток, фотометр определяет только их количество.

Показания к применению гемихромного метода

Методика для подсчета количества гемоглобина проводится в лабораториях постоянно. Для назначения исследования необходимы различные показания.

• Диспансеризация человека для определения состояния его здоровья. В этом случае исследование проводят 1 раз в год.
• Системные заболевания, вызывающие снижение гемоглобина. К ним относят недостаток витаминов и фолиевой кислоты, различные форы анемии, нарушение образования форменных элементов в костном мозге.
• Проверка здоровья беременной женщины. Во время беременности показатели могут быть незначительно или резко снижены. В первом случае терапевтические меры не требуются. Если показатель снижен значительно, назначают препараты, способствующие его повышению, так как дефицит гемоглобина может негативно сказаться на росте формирование плода.
• Проверка количества гемоглобина во время лечения. Врач корректирует дозировку лекарственных препаратов или заменяет их на другие медикаменты.

Возможные ошибки в применении гемихромного метода

Во время проведения методики могут быть допущены ошибки, которые приведут к получению неправильного результата:

• неправильно настроенный прибор, допущение ошибки в его калибровке;
• неверный расчет показателя с помощью формулы;
• неверная дозировка раствора или крови, ошибка в подборе пипеток для взятия определенного количества жидкости;
• стояние полученного образца чрезмерно продолжительное количество времени;
• использование неправильных реагентов или истечения срока их годности;
• использование высоких или низких температур во время исследования;
• ошибка во время забора крови (работа кулаком, резкое перемещение пациента из лежачего состояние в положение сидя);
• отсутствие добавления антикоагулянта, вследствие чего образуется сгусток и проведение анализа невозможно;
• использование загрязненных приборов для хранения, перенесения, исследования биологической жидкости.

Для исключения ошибок в полученных данных врач должен назначать несколько анализов. Если результаты будут схожи, это говорит о правильности исследования. Ошибки могут быть не только в лаборатории, но и в неправильной подготовке пациента. Поэтому врач должен предупредить о необходимых действиях, которые он должен совершить до исследования. 

Гемихромный метод определения гемоглобина – исследование последнего поколения, которое предотвращает воздействие токсических веществ на организм врачей-лаборантов. Показатели, полученные с помощью методики достоверны. Определение количества гемоглобина помогает лечащему врачу в постановке диагноза, определении состояния пациента. Важно правильно подготовиться к исследованию, чтобы исключить риск ошибки. 

Читайте о том, какие методы определения гемоглобина в крови еще существуют.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео