Гемоглобин гемоглобинцианидным методом 600 опр

Принцип этого метода заключается в том, что после взаимодействия с трансформирующим раствором, содержащим ацетонциангидрин, гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), который под влиянием CN-ионов образует окрашенный в красный цвет комплекс — цианметгемоглобин (ге-миглобинцианид). Оптическую плотность раствора определяют на универ­сальном или специальном фотоэлектроколориметре (гемоглобинометре).

Оснащение

1.Гемоглобинометр фотоэлектрический типа ГЭ-3.

2.Трансформирующий раствор с ацетонциангидрином.

3.Пипетка объемом 0,02 мл.

4.Пипетка объемом 5 мл.

5.Пробирка.

Техника выполнения

1.0,02 мл крови приливают в 5 мл трансформирующего раствора в пробирки (разведение 1:250) и хорошо перемешивают.

2.Через 10 минут (раствор остается стабильным в течение более 24 часов) измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптиче­ского пути 10 мм против холостой пробы трансформирующего раствора или на гемоглобинометре.

3.Концентрацию гемоглобина в «г/л» определяют по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта гемиглобинцианида.

Источник ошибок

Отклонения получаемых значений могут быть связаны только с погрешно­стями взятия крови или с неисправностью фотометрической аппаратуры.

Опенка результатов

В норме концентрация гемоглобина в крови составляет: у женщин 120 -145 г/л, у мужчин- 130 – 165 г/л. Снижение концентрации гемоглобина обычно сочетается с эритропенией, а повышение – с эритроцитозом.

Концентрация гемоглобина после рождения составляет 210 г/л (180-240 г/л). Дальнейшая динамика этого показателя соответствует измене­ниям, наблюдающимся со стороны концентрации эритроцитов.

Определение цветового показателя и среднего содержания гемоглобина в эритроците.

Расчетные показатели, характеризующие состояние красной крови

Исходя из данных концентрации эритроцитов и гемоглобина, можно оценить степень насыщения эритроцитов гемоглобином. В настоящее время во всех странах принято рассчитывать среднее содержание гемоглобина в эритроците, но нередко пользуются и цветовым (цветным) показателем. Ин­формативность этих двух параметров совпадает.

1. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) ССГЭ получают, разделив содержание гемоглобина в 1 литре крови на концентрацию эритроцитов в том же объеме крови:

рад

ССГЭ = (пикограммы, пг), где

[Э]

[НЬ] – концентрация гемоглобина в 1л крови (г/л) [Э] – концентрация эритроцитов в 1 л крови (Т/л)

2.Цветовой (цветной) показатель (ЦП)

ЦП является относительным показателем, характеризующим степень насыщения эритроцитов гемоглобином. Вычисляется путем деления полу­ченного ССГЭ на условно нормальное ССГЭ (166,7 г/л : 5 Т/л = 33,3 пг) или непосредственно, исходя из данных концентрации гемоглобина и эритроци­тов, по формуле:

Г*3

ЦП =—— (усл. ед), где

Э*100

Г – концентрация гемоглобина в исследуемой крови (г/л); Э – концентрация эритроцитов в исследуемой крови (Т/л).

Оценка результатов

В норме ССГЭ составляет 28-34 пг, ЦП – 0,85-1,05. На величинах ССГЭ и ЦП основана классическая классификация анемий. Так, при ССГЭ < 28 пг или ЦП <0,85 говорят о гипохромной анемии и гипохромии (гипохромазии) эритроцитов, которая связана с истинным снижением содер­жания гемоглобина в эритроците или с уменьшением его объема. Если ССГЭ >34 пг или ЦП >1,05, то такая анемия носит название гиперхромной. Гипер-хромия (гиперхромазия) эритроцитов обусловлена исключительно увеличе­нием объема эритроцитов, а не повышением концентрации гемоглобина в единице объема клетки. ССГЭ и ЦП не имеют существенной возрастной динамики у здоровых детей.

Определение СОЭ

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) СОЭ – скорость оседания эритроцитов, измеряемая при отстаиваниистабилизированной крови в стандартных условиях и зависящая от изменений

химических и физических свойств крови.

Оснащение

1. Аппарат Панченкова (рис. 13), состоящий из специального штатива с гнез­дами и резиновыми прокладками и специальных капилляров. Капилляры представляют собой стеклянные трубки стандартной длины с просветом ка­нала около 1 мм. На стенку капилляра нанесена миллиметровая (!) шкала длиной 100 мм. Верхние деление шкалы отмечено цифрой «0» и буквой «К» (кровь).

2. 2.5%-ный раствор цитрата натрия трехзамещенного.

3. Часовое стекло или предметное стекло с лункой.

Техника выполнения

1.В капилляр набирают 5%-ный раствор цитрата натрия до метки «75» и вы­дувают на часовое стекло.

2.Затем к раствору антикоагулянта добавляют кровь, набираемую в капилляр до метки «0» («К»), перемешивают.

3.Капилляр заполняют полученной смесью до метки «О» («К») и фиксируют в штативе.

4.Через 1 час производят учет СОЭ, определяя, сколько делений шкалы (в мм) занимает слой плазмы, очистившийся в результате оседания эритроци­тов.

Оценка результатов

В норме СОЭ составляет у женщин 2-15 мм/ч, у мужчин – 1-10 мм/час. Величина СОЭ зависит от концентрации эритроцитов (увеличивается при эритропении, уменьшается при эритроцитозе), вязкости крови (понижается при сгущении крови), соотношения различных фракций белков крови (уве­личивается при повышении концентрации бета- и гамма-глобулинов, фибри­ногена). СОЭ увеличивается при беременности (в связи с повышением кон­центраций фибриногена).

У новорожденных наблюдается замедление СОЭ, обусловленное эритроцитозом и низкой концентрацией фибриногена. В дальнейшем значение СОЭ соответствует уровню взрослых.

Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:

• феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
• цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
• дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
• не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.

Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный метод проводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный метод с калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.

Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.

Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.

• Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
• Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
• Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
• Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.

Формула для определения количества гемоглобина:

Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10

• Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
• Eст – экстинкция стандартного образца;
• С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
• К – коэффициент разведения биологической жидкости;
• 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
• 10 – число для пересчета г% в г/л.

После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.

Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.

Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.

Плюсы гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Исследование с помощью добавления цианида к крови имеет множество положительных сторон:

• исследование унифицировано, то есть считается достоверным, одобрено Комитетом здравоохранения;
• методика позволяет перевести все формы гемоглобина в одну, которую возможно рассчитать с помощью фотоколориметра;
• полученный гемиглобинцианид имеет длину волны 540 м, которую улавливает полуавтоматический оптический прибор для определения показателя;
• использование дешевых реактивов, которые не приносят клиническому учреждению больших финансовых затрат;
• простата методики, которую может выполнить любой врач лаборант;
• большой срок годности реактивов;
• применение незначительного количества реактива для 1 исследования, что позволяет проводить множество анализов за 1 сутки;
• быстрота проведения анализа, которая переводит его в экспресс-метод;
• применение полуавтоматического анализатора, самостоятельно подсчитывающего данные, что снижает риск получения врачебной ошибки.

Минусы гемиглобинцианидного метода определения гемоглобина

Использование цианидных реактивов в лабораторной диагностике устарела. Это вызвано тем, что исследование имеет следующие отрицательные стороны:

• возможность поражения кожных покровов и дыхательных путей врача-лаборанта реактивами;
• наличие более современных методов, которые более безопасны для лаборанта;
• возможность врачебной ошибки в неправильной подборке дозировки реактивов;
• прибор не выдает данные по определению формы или размеров клеток, поэтому для их выявления требуется проведение дополнительных анализов.

Так как цианидные соединения являются вредными для человека, разработан гемихромнй метод. Он полностью безопасен и на данный момент вытесняет гемиглобинцианидную методику из клинической лабораторной диагностики.

Показания к применению гемиглобинцианидного метода

Для проведения методики необходимые показания я ее проведению.

• Плановая диспансеризация пациента, проверка состояния его здоровья. Определение гемоглобина является одним из наиболее частых методик в лабораторной диагностике, так как показатель влияет на состояние множества тканей и органов.
• Наличие заболевания красного костного мозга, которое приводит к снижению количества эритроцитов или сразу всех ростков кроветворения.
• Чрезмерная продукция эритроцитов в красном костном мозге, которая приводит к эритроцитемии. Повышение количества Hb до критических значений не является положительной стороной, состояние требует лечебных мероприятий.
• Подозрение на анемию.
• Определение показателей во время проведения лечебных мероприятий. После получения данных врач может скорректировать дозировку препаратов или заменить их.

Возможные ошибки в применении гемиглобинцианидного метода

Исследование крови с помощью методики может быть неточной. Это вызвано тем, что возможны различные ошибки в ее проведении:

• нарушения в подготовке пациента к исследованию (отсутствие диеты, использование активных физических нагрузок, употребление некоторых категорий лекарств);
• нарушение правил забора крови (резкое изменение положения тела пациента в пространстве, работа кулаком при взятии венозной крови, использование не стерильных инструментов и пробирок);
• отсутствие добавления антикоагулянта, что приводит к образованию сгустка и делает невозможным проведение исследования;
• чрезмерно долгое стояние пробы без проведения исследования;
• неправильная дозировка реактивов, вышедший срок годности химических веществ, неправильно подобранная концентрация жидкости для разведения, отсутствие перемешивания крови после добавления реактива, осуществление исследования без настаивания полученной жидкости после добавления химических веществ;
• ошибка в расчете формулы;
• использование загрязненных приборов или фотоколориметра, что делает проведение исследования невозможным, так как прибор не может рассчитать длину волны.

Для исключения получения неточных данных врач должен назначить несколько исследований. Если оба показателя примерно одинаковы, это говорит о достоверности. Перед назначением анализа врач должен предупредить о подготовительных мероприятиях, которым должен в точности руководствоваться пациент. Это связано с тем, что уровень показателя зависит от состояния организма и воздействующих на него факторов. 

Гемиглобинцианидный метод – точная методика, которая использовалась в лабораториях раннее. На данный момент она заменена другими исследованиями, так как применение цианидных компонентов может нанести вред здоровью врача-лаборанта. Несмотря на это, анализ считается наиболее точным и достоверным, поэтому он был унифицирован Комитетом здравоохранения. Методика проста в использовании, реактивы недорогие, анализы проводятся быстро. 

Современным и точным методом измерения гемоглобина сегодня является гемихромный метод. Возможно, Вам будет интересно почитать обзор всех методов определения гемоглобина в крови.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео