Гемоглобин состоит из двух полипептидных
ЧАСТЬ I. КОНФОРМАЦИЯ И ДИНАМИКА
ГЛАВА 3. ПЕРЕНОСЧИКИ КИСЛОРОДА—МИОГЛОБИН И ГЕМОГЛОБИН
3.11. Гемоглобин состоит из четырех полипептидных цепей
Обратимся теперь к гемоглобину-белку, родственному миоглобину. Если миоглобин состоит из одной полипептидной цепи, то гемоглобин-из четырех. Эти четыре цепи удерживаются вместе нековалентными связями. Каждая цепь содержит один гем, и, таким образом, в молекуле гемоглобина имеются четыре участка связывания кислорода. Гемоглобин А-основной гемоглобин взрослого организма-состоит из двух цепей одного типа, называемых а-цепи, и двух цепей другого типа, называемых β-цепи. В целом субъединичная структура гемоглобина А описывается формулой α2β2. У взрослых есть, кроме того, минорный гемоглобин А2, на долю которого приходится примерно 2% общего количества гемоглобина; субъединичная структура этого гемоглобина α2δ2. Эмбрионы содержат другие гемоглобины. На ранних этапах эмбрионального развития выявляется гемоглобин плода α2ε2. На смену ему приходит гемоглобин F с субъединичной структурой а2у2. Биологическое значение этих разных гемоглобинов представляет собой очень интересную проблему, которую мы обсудим в следующей главе. Общая для всех перечисленных гемоглобинов α-цепь содержит 141 аминокислотный остаток, β, δ и γ-Цепи содержат по 146 остатков с очень схожей последовательностью аминокислот (рис. 3.23).
Рис. 3.23. β-, γ- и δ-Цепи гемоглобинов человека обладают сходными аминокислотными последовательностями. Для примера показаны участки трех цепей с остатками от F1 до F9
3.12. Рентгеноструктурный анализ гемоглобина
Как упоминалось ранее, пространственную структуру гемоглобина А определили Макс Перутц и сотрудники. Этот монументальный труд был начат в 1936 г., когда для выполнения дипломной работы Перутц уехал из Австрии в Англию в Кембридж и начал работать в лаборатории Джона Бернала (J. Bemal), где двумя годами ранее были получены первые рентгеновские отпечатки кристаллов белка. Бернал и студентка- дипломница Дороти Кродфут Ходжкин (D. С. Hodgkin) получили отличные отпечатки дифракции пепсина и таким образом показали, что белкам свойственна точно определенная структура. Еще в 1934 г. они предсказали перспективность применения рентгеноструктурного анализа как метода, «позволяющего получить гораздо более подробные сведения о белковой структуре по сравнению с тем, что могли дать предшествовавшие физические и химические подходы». Прошло, однако, более 20 лет, прежде чем этот прогноз оправдался. В тот период, когда Перутц избрал объектом своей работы гемоглобин, самым высокомолекулярным соединением с расшифрованной структурой был краситель фталоцианин, состоящий из 58 атомов. Перутц же взялся за молекулу в сотни раз большую. Не удивительно, что «мои товарищи смотрели на меня с жалостливой улыбкой… По счастью, экзаменаторы, принимавшие мою дипломную работу, не настаивали на окончательном установлении структуры, иначе бы я оставался студентом-дипломником в течение 23 лет». Однако Лоуренс Брэгг (L. Bragg), который вместе со своим отцом впервые в 1912 г. применил рентгеноструктурный анализ, стал в это время во главе Кавендишской лаборатории и поддержал работу Перутца. Он писал: «Я не обманывал себя в отношении перспективы. Дело выглядело так, как если бы нулевую вероятность успеха помножили на бесконечную важность искомого результата; результат этой математической операции был никому не известен». Успех пришел в 1959 г., когда Перутц получил карту электронной плотности низкого разрешения для оксигемоглобина лошади. Впоследствии были получены карты высокого разрешения как для окси-, так и дезоксигемоглобина лошади и человека. Гемоглобины этих двух видов очень близки по своей структуре.
3.13. Четвертичная структура гемоглобина
Молекула гемоглобина имеет почти правильную форму шара диаметром 55 А. Четыре цепи, образующие молекулу гемоглобина, расположены в виде тетраэдра (рис. 3.24). Четыре гема, по одному у каждой субъединицы, находятся в углублениях на внешней стороне молекулы. Эти четыре кислородсвязывающих участка расположены далеко друг от друга: расстояние между двумя ближайшими атомами железа составляет 25 А. Каждая α-цепь контактирует с обеими β-цепями. В то же время взаимодействия между двумя а- или между двумя β-цепями незначительны.
Рис. 3.24. Модель гемоглобина при низком разрешении. α-Цепь показана желтым, β-цепь-синим, гем-красным
3.14. α- и β-Цепи гемоглобина очень сходны с миоглобнном
Пространственные структуры миоглобина и α- и β-цепей гемоглобина обладают поразительным сходством (рис. 3.25). Близкое подобие в конфигурации основных цепей этих белков оказалось неожиданным, поскольку в последовательности аминокислотных остатков в этих трех полипептидных цепях существует много различий. Собственно, только 24 положения из 141 идентичны во всех трех полипептидных цепях; это показывает, что очень сходные пространственные структуры могут быть обусловлены совершенно разной последовательностью аминокислот (рис. 3.26).
Рис. 3.25. Сравнение конформаций главной цепи миоглобина и (3-цепи гемоглобина. Сходство конформаций совершенно очевидно
Рис. 3.26. Сравнение аминокислотных последовательностей миоглобина кашалота и α- и β-цепей гемоглобина человека на примере участка от остатка F1 от остатка F9. Последовательности аминокислот имеют гораздо меньше сходства, чем пространственные структуры этих трех полипептидных цепей
Совершенно очевидно, что пространственная конфигурация миоглобина кашалота и α- и β-цепей гемоглобина человека имеет общебиологическое значение. В сущности, эта структура свойственна всем миоглобинам и гемоглобинам позвоночных. Сложная конфигурация полипептидной цепи, впервые выявленная на примере миоглобина, это та основная форма, которую природа предназначила для переносчика кислорода: смысл ее в том, что вокруг гема создается такое микроокружение, которое обеспечивает обратимость связывания кислорода.
… среди лабораторных исследований одним из наиболее массовых является исследование концентрации гемоглобина крови.
Гемоглобин – красный пигмент крови (эритроцитов) человека и животных. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около ~ 340000000 молекул гемоглобина. В крови человека в среднем содержится ~ 14,5% гемоглобина, его общее количество ~ 750 г. В эритроцитах гемоглобин находится в растворенном состоянии, несмотря на то, что его содержание в них более 30%.
Гемоглобин представляет собой сложный белок, относящийся к группе гемопротеинов; белковый компонент в котором представлен глобином, небелковый – простетической группой. Простетическая группа в молекуле гемоглобина представлена 4 одинаковыми железопорфириновыми соединениями, которые называются гемами. Молекула гема состоит из порфирина IХ, связанного с железом двумя атомами азота ковалентными и двумя другими атомами азота координационными связями. Атом железа (II) расположен в центре гема и придает крови характерный (красный) цвет, степень его окисления не изменяется независимо от присоединения или отдачи кислорода.
Видовые различия гемоглобина обусловлены химическим составом и строением глобина. Гемоглобины представляют собой тетрамерные белки, молекулы которых образованы различными типами полипептидных цепей, обозначаемых как , , , . В состав молекулы входят по 2 полипептидные цепи двух разных типов, каждая из которых оборачивает 1 гем гемоглобина. Гемоглобины различных видов различаются вторичной, третичной и четвертичной структурами, и индивидуальные свойства гемоглобинов неразрывно связаны с их структурами. Известно, что гемоглобин человека состоит из двух равных половин, каждая из которых образована двумя одинаковыми полипептидными цепями. У человека обнаружены гемоглобины различных типов, которые отличаются по химическому строению. В крови взрослого человека содержится гемоглобин А (HbA), состоящий из двух – и двух -полипептидных цепей (22). В дополнение к основному HbA в крови взрослого человека обнаружен гемоглобин A2 (HbA2), состоящий из двух – и двух -полипептидных цепей (22), на долю которого приходится ~ 2,5% от всего гемоглобина. Кроме того, известен фетальный гемоглобин F (HbF) – гемоглобин новорожденных, состоящий из двух – и двух -полипептидных цепей (22), и отличающийся от HbA вторичной, третичной и четвертичной структурами, что обусловливает их различия: по спектральным характеристикам, электрофоретической подвижности, устойчивости к тепловой денатурации и др. Кровь новорожденного ребенка состоит на ~ 80% из HbF, который к концу первого года жизни почти целиком заменяется на HbA (в крови взрослого человека содержится до ~ 1,5% HbF от общего количества гемоглобина).
Физиологическая роль гемоглобина заключается в транспорте кислорода (О2) к органам и тканям, транспорте углекислого газа (СО2) от тканей к легким (образовавшиеся при этом соединения называются оксигемоглобином – HbО2, и карбоксигемоглобином – HbCO2, соответственно); кроме этого он является внутриклеточным буфером, который поддерживает оптимальную для метаболизма pH. Следует заметить, что реакция присоединения молекулярного кислорода не является истинным окислением гемоглобина, так как валентность железа в гене при этом не изменяется, и эту реакцию правильнее называть оксигенацией. Истинное окисление гемоглобина происходит только тогда, когда железо переходит в трехвалентное состояние. В крови гемоглобин существует по крайней мере в четырех формах: оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемоглобин. В эритроцитах молекулярные формы гемоглобина способны к взаимопревращению, их соотношение определено индивидуальными особенностями организма.
Нормальная концентрация гемоглобина у взрослого колеблется от 130 до 185 г/л (80 – 115 %). За среднюю величину принимают 160 г/л (100 %). При рождении ребенка пуповинная кровь содержит 140 – 190 г/л гемоглобина. Но в течение первых часов антенатальной жизни общая концентрация гемоглобина повышается до 165 – 225 г/л. Через несколько дней после рождения содержание гемоглобина уменьшается и далее в первые месяцы жизни наблюдается трименонредукция (трименонанемия) – нормальное временное постепенное снижение уровня гемоглобина, концентрация которого к третьему месяцу доходит до 63 – 82 % (100 – 130 г/л). Затем содержание гемоглобина медленно повышается и к концу первого года жизни достигает средних величин – около 76 % – 120 г/л (у детей в раннем возрасте нет различия между мужским и женским полом). После первого года жизни повышение продолжается и достигает нормальных (для взрослого) величин в пубертате. Так как у ребенка в первые месяцы жизни наблюдается физиологическая анемия (трименонредукция), следует учитывать, что уменьшение концентрации Hb в этом возрасте до 60 – 65 % не следует считать патологическим состоянием, нуждающимся в лечении.
Нормальные величины гемоглобина у взрослого человека со среднестатистической массой тела: у мужчин – 130 – 160 г/л, у женщин – 120 – 140 г/л. Содержание гемоглобина снижается на ~ 10% в промежутке времени от 17 до 07 час утра, а также после еды. Снижение гемоглобина от нормальных величин на ~ 6% наблюдается при взятии пробы в положении лежа. Незначительное, но диагностически значимое, снижение нижнего порога нормальных величин гемоглобина встречается у мужчин возрастной группы 65 – 74 года.
Клиническое значение:
снижение концентрации гемоглобина: анемии;
повышение концентрации гемоглобина: полицитемия, гемоконцентрация при дегитратации, ожогах, кишечной непроходимости, упорной рвоте; пребывание на больших высотах, чрезмерная физическая нагрузка или возбуждение; сердечно-сосудистая патология, обычно врожденная, приводящая к значительному венозному сбросу; заболевания легких, приводящие к снижению легочной перфузии, плохой аэрации легких, легочной артериальной фистуле; хроническое химическое воздействие нитритов, сульфонамидов, вызывающих образование мет- и сульфогемоглобина.
В лаборатории для определения концентрации гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора. «Старыми» методами, все еще применяемыми в ряде лабораторий являются: сапониновый и методе Сали. При использовании сапонинового метода тельца Гейнца (маленькие округлые включения в эритроцитах, образованные из денатурированного гемоглобина) не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20 – 30%. В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает ~ 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; харак-тера освещения и пр.
Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются. Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа.
[13-165]
Электрофорез гемоглобина для диагностики гемоглобинопатий
3045 руб.
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов): 2α и 2β, каждая из которых связана с гемом. Гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Посредством электрофореза гемоглобина можно проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Синонимы английские
Serum Hemoglobin Electrophoresis.
Метод исследования
Электрофорез и денситометрия.
Единицы измерения
Мг/дл (миллиграмм на децилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Венозную кровь.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов) – 2α и 2β, – каждая из которых связана с гемом. HbA обеспечивает адекватный газообмен и тканевую оксигенацию. Фракция HbA2 – второстепенная форма гемоглобина, имеет формулу 2α2δ. Также у взрослого допустимо наличие следовых количеств фетального гемоглобина HbF (2α2γ), который является преобладающей фракцией в течение внутриутробного периода. В течение первых 6 месяцев жизни HbF замещается HbA.
Нарушения структуры гемоглобина обычно разделяют на две группы: гемоглобинопатии и талассемии, хотя талассемии являются формой гемоглобинопатии. Талассемии представляют собой нарушения синтеза α-, β- или обеих цепей гемоглобина. Также могут отмечаться нарушения синтеза δ-, γ- цепей. Большинство вариантов α- и β-талассемий сопровождается изменением уровня HbF и HbA2, поэтому определение этих изоформ может быть использовано для скрининга этих состояний.
Остальные гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Наиболее распространённые и клинически значимые аномальные варианты гемоглобина: S, D, E, C. Варианты HbS и HbD – патологические формы гемоглобина, которые обладают идентичной миграцией в щелочном геле и являются результатом точечных мутаций гена, кодирующего β-глобин. Варианты Е и С при данном методе мигрируют в составе фракции HbA2, при их наличии фракция HbA2 достигает более 25 %. Наибольшее клиническое значение представляет HbS-вариант, который приводит к серповидноклеточной анемии.
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Электрофорез является чувствительным методом, с помощью которого можно исключить гемоглобинопатии либо определить тактику дальнейшего обследования для установления точного диагноза заболевания. Метод характеризуется высокой внутрипостановочной (SD
Метод исследования основан на электрофорезе гемоглобина, полученного при лизисе отмытых эритроцитов обследуемого. После разделения гемоглобина на фракции производится окрашивание зон миграции. Содержание гемоглобина в составе фракций измеряется с помощью цифровой денситометрии.
Когда назначается исследование?
- Скрининг гемоглобинопатий;
- наличие семейного анамнеза гемоглобинопатий, планирование семьи;
- микроцитарная анемия, не связанная с дефицитом железа;
- гемолитическая анемия неустановленной этиологии;
- обнаружение изменённых эритроцитов (серповидная деформация) при микроскопическом исследовании крови.
Что означают результаты?
Референсные значения
Гемоглобин A | ≥ 96,5% |
Гемоглобин A2 | |
Гемоглобин F | |
Гемоглобин S/D | 0 % |
Важные замечания
- Тест обладает высокой достоверностью при скрининге β-талассемий, вариантов, приводящих к серповидноклеточной анемии, и синдромов персистенции фетального гемоглобина.
- При использовании данного метода может быть затруднена индентификация α+-талассемии (талассемия с одной мутацией).
Также рекомендуется
02-029 Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)
06-276 Гепсидин-25
06-017 Железо в сыворотке
Кто назначает исследование?
Гематолог, терапевт, врач общей практики.