Измерение гемоглобина у животных
Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путем измерения красящей способности крови (колориметрически).
Для клинических целей используется последний метод, который требует небольшого количества крови и дает возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространенным является метод Говерса в видоизменении Сали.
Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определенной концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина в этом случае определяется колориметрически.
Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того, что стандартная жидкость довольно быстро выцветает, в последнее время выпущены стандарты из цветного стекла, окрашенные под цвет солянокислого гематина металлическими окислами. Эти стандарты не выцветают даже под действием прямого солнечного света.
Между стандартными пробирками помещается пробирка, имеющая деления от 10 до 140 или от 10 до 170 такого же диаметра, как и первая. Пробирка с делением от 10 до 140 предназначена для определения гемоглобина в единицах Сали, а от 10 до 170—в процентах.
Подставка, в которой помещаются стандартные и градуированные пробирки, представляет собою деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для них. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое дает рассеянный свет; на его фоне резко оттеняется окраска стандарта и испытуемой сыворотки.
Для взятия крови прилагается капиллярная пипетка с меткой 20 мм, которая определяет количество крови, взятой для исследования.
Кроме гемоглобинометра, для определения гемоглобина необходимо иметь N/10 раствор НС1 и дистиллированную воду.
Техника определения следующая. В градуированную пробирку до метки 20 набирается N/10 раствор НС1, затем в капилляр до метки 20 мм3 насасывается кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят ее в пробирку
Рис. Гемоглобинометр Сали.
С соляной кислотой. Кровь осторожно выдувают в А710 раствор соляной кислоты, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку.
Капилляр промывается 2 или 3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость постепенно становится коричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дистиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по мере изменения цвета и приближения его к стандарту,—то одной капле. Кровь смешивается или стеклянной палочкой с утолщением на конце или же покачиванием прсбирочки. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась.
Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учет ведется по нижнему мениску жидкости. Допустимой ошибкой при вторичном исследовании той же самой крови считается расхождение в пределах пяти делений. Метка 80 на пробирке с делением до 140 и цифра 100 на пробирке с делением до 170 соответствует 16,0—17,0 гемоглобина в 100 мл крови. Чтобы получить абсолютную цифру, показывающую количество гемоглобина в граммах в 100 мл крови, необходимо показания гемометра в процентах Сали умножить на 0,17, а количество в единицах— на коэффициент 0,2125.
Вид животного | Средний показатель в % Сали | Колебания | В 100 мл крови в г | Фамилия автора |
Крупный рогатый скот…. Овцы Козы Буйволы Яки Верблюды Лошади Свиньи Собаки Кошки Кролики Куры Гуси | 65 68 63 49 57 90 80 67 80 65 69 75 95 | 56—74 54—80 45—81 28—70 36—78 66—114 50—110 55—79 65—95 47—83 51—87 51—99 80—110 | 11,0 11,6 10,7 8,3 9,6 15,2 13,6 10,2 13,6 11,0 11,7 12,7 16,1 | Д. Соколов Л. Лебедев B. Чагин К. Мавсун-Заде П. Карасев Н. Семушкин C. Хрусталев A. Васильев B. Зайцев C. Веремейчик |
Количество гемоглобина у здоровых животных колеблется в следующие пределах (см. табл. на стр. 418).
Колебания гемоглобина зависят от возраста, пола, породы, характера кормления и некоторых других условий. При патологических процессах количество гемоглобина может быть увеличено и уменьшено по сравнению с нормальными показателями.
Увеличение количества гемоглобина носит название плейохромии. Она может возникнуть вследствие сгущения крови при потере жидкости организмом (понос, рвота, потливость), при образовании экссудатов и транссудатов, Плейохромию отмечают при кровепятнистой болезни лошадей, интоксикациях и отравлениях. Повышение количества гемоглобина отмечается при физическом напряжении лошади. При хорошей подготовке (тренировка) количество гемоглобина остается почти без изменений.
Уменьшение гемоглобина (олигохромемия) встречается довольно часто и особенно при заболеваниях, связанных с анемией. Олигохромемия является симптомом острых и хронических заболеваний, различных по своему происхождению.
Олигохромемия связана с уменьшением общего количества эритроцитов или обеднением эритроцитов гемоглобином. Следовательно, олигохромемия определяет не только степень, но и характер анемии. Необходимо, однако, учесть, что правильная оценка может быть сделана только при условии подсчета эритроцитов и определения величины цветного показателя.
Определение цветного показателя. Цветной показатель дает представление об отношении гемоглобина к красным кровяным тельцам. Метод определения цветного показателя основан на сравнении. Если в норме цветной показатель равен примерно единице, то изменение этой цифры в сторону увеличения или уменьшения рассматривается, как весьма важный показатель нарушения соотношения между эритроцитами и гемоглобином.
У животных определение цветного показателя проводится по формуле:
Гемоглобин 2 Эритроциты 2 Гемоглобин 2 х эритроциты 1
Гемоглобин 1 / эритроциты 1 = гемоглобин 1 x эритроциты 2
Где гемоглобин 1 и эритроциты 1 показывают среднее количество гемоглобина и эритроцитов у здорового животного и гемоглобин 2 и эритроциты 2—найденное количество гемоглобина и эритроцитов у исследуемых животных. Если у лошади взять за норму количество гемоглобина 75, а эритроцитов 7 500 000, то цветной показатель будет равен единице. Всякое отклонение в количестве гемоглобина и эритроцитов поведет к изменению цветного показателя. Необходимо учитывать только такие отклонения от нормы, которые превышают 15%. Небольшие отклонения учитывать не следует.
Определение цветного показателя имеет значение в дифференциации анемий. При постгеморрагических анемиях, когда имеется одновременно уменьшение как количества эритроцитов, так и гемоглобина, цветной показатель приближается к единице; ниже единицы цветной показатель бывает при вторичных анемиях, при которых снижается количество гемоглобина, при почти нормальном или слегка сниженном количестве эритроцитов; выше единицы цветной показатель отмечается при гемолитических анемиях, когда в ток крови выбрасывается значительное количество молодых клеток (повышенная регенерация).
Для суждения о средней насыщенности эритроцитов гемоглобином практически можно использовать определение кровяного числа. Оно получается делением найденного количества гемоглобина на число эритроцитов в миллионах, например:
75% / 7(000000) = 11 или 90% / 10(000000) =9
Величина кровяного числа неодинакова у различных животных и зависит от количества эритроцитов и гемоглобина в норме, но в среднем она приближается к 10.
27 сентября 2018 г.
«Люди забыли эту истину, — сказал Лис. — Но ты не должен ее забывать. Мы всегда будем в ответе за тех, кого приручили». Эта фраза из произведения «Маленький принц», как нельзя лучше описывает отношения человека и животного. Братья наши меньшие всегда будут нуждаться в ежедневной заботе, и наш долг – ее обеспечить.
Одним из распространенных видов исследования состояния здоровья животного является анализ крови. Среди всех компонентов, входящих в ее состав, важнейшую функцию выполняет гемоглобин, а процентное содержание этого вещества – показатель благополучия или наличия патологии в организме. Своевременное обнаружение отклонений от нормы позволит назначить эффективное лечение.
Гемоглобин – это сложный железосодержащий белок, который обеспечивает перенос кислорода из органов дыхания в ткани. Он также обладает свойством частично связывать углекислый газ и выводить его из организма. У человека и позвоночных животных содержится в эритроцитах, а у беспозвоночных – в плазме крови и других тканях. Благодаря этому белку повышается тонус, активизируется обмен веществ организма и укрепляется иммунитет.
На уровень гемоглобина влияет множество факторов: пол, возраст, порода, кормление, условия содержания, физические нагрузки, инфекционные болезни и даже высота над уровнем моря.
Содержание этого белка в крови животных в лабораторных условиях контролируется с помощью применения тест-наборов. В основном это фотометрические методы, позволяющие точно определить его концентрацию. У здоровых животных она составляет (г/л): крупный рогатый скот – 99-129; лошади – 80-140; овцы – 90-133; козы – 100-150; свиньи – 90-110; кошки – 100-140; собаки – 110-170; кролики – 105-125; куры – 80-120; утки – 100-125. Отклонение от нормы в меньшую или большую сторону является патологией и свидетельствует о нарушениях в организме животного. Так, например:
– увеличение количества гемоглобина в крови – гиперхромемия –наблюдается при обезвоживании по причине рвоты, диареи, потливости, при образовании жидкостей (транссудат – отёчная жидкость, скапливающаяся в полостях тела; экссудат – жидкость, выделяющаяся в ткани или полости организма из мелких кровеносных сосудов при воспалении);
– снижение гемоглобина в крови – олигохромемия – возникает при анемиях, вследствие кровотечений, в том числе внутренних, ряда инфекционных болезней, истощения, гемолиза эритроцитов, дефицита железа, витаминов В12 и фолиевой кислоты.
Заподозрить изменение уровня гемоглобина в крови животного позволяет наблюдение за питомцем. Так, к симптомам, позволяющим предположить увеличение концентрации гемоглобина, относятся: потеря аппетита; повышенная утомляемость; вялость и апатия; бледность или покраснение кожных покровов; расстройства в работе ЖКТ. Кровь животного становится темной и густой. Незначительный рост уровня гемоглобина может быть вызван физиологическими причинами, если при повторном анализе наблюдается норма – причин для беспокойства нет.
В случае понижения уровня гемоглобина может наблюдаться: синюшность или бледность слизистых оболочек; слабость и сонливость; учащение пульса и частоты дыхания; озноб и понижение базовой температуры тела (как следствие замедления обменных процессов). В связи с тем, что разрушение эритроцитов происходит по причине нехватки в организме железа, у животных может отмечаться металлический запах из пасти.
Низкий уровень гемоглобина встречается чаще и вызывает большую озабоченность, так как пониженные показатели указывают на наличие серьезных нарушений в функционировании организма животного. Недостаток гемоглобина при беременности, способен привести к серьёзным неблагоприятным последствиям – плод может недополучить кислород, необходимый для нормального развития головного мозга; возникает риск преждевременных родов.
При проявлении у животного симптомов изменения уровня гемоглобина, необходимо незамедлительно обращаться в ветеринарную клинику для прохождения обследования.
В биохимическом отделе ФГБУ «Челябинская МВЛ», подведомственного Россельхознадзору, проводятся исследования по определению содержания гемоглобина в крови домашних и сельскохозяйственных животных.
При диагностике важное значение имеет то, насколько правильно материал был доставлен в лабораторию. Специалисты ветеринарных клиник рекомендуют производить забор крови с утра до приема воды и пищи, по возможности в одни и те же часы. При этом животное должно находиться в спокойном состоянии. При взятии крови в пробирку, для предупреждения свертывания крови, используются антикоагулянты (противосвертывающие вещества) на 10 мл крови:
– щавелевокислый натрий (калий или аммоний) – 0,01-0,02 г (оксалатная кровь);
– лимоннокислый натрий – 0,02 г (цитратная кровь);
– фтористый натрий – 0,01 г;
– гепарин – 1 капля раствора, содержащего в 1 мл 5000 ME гепарина (гепаринизированная кровь).
Антикоагулянты вносят в пробирку, затем в нее собирают кровь; пробирку плотно закрывают резиновой пробкой и несколько раз переворачивают в течение 1-2 минут для наилучшего смешивания содержимого.
Любите своих животных, и они ответят вам взаимностью!
Е.Е. Федорова, специалист по связям с общественностью,
Л.А. Морозова, и.о. директора
Определение содержания гемоглобина в крови животных является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора [3].
Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и
быстрые в исполнении. Кровь животного – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа [1].
Повышение: некоторые формы гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.
Понижение (анемия): различные виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.
Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.
Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.
При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.
При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа [7].
Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.
Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе [6].
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА
Количество гемоглобина можно определить или спектроскопически, посредством определения количества железа, или путём измерения красящей способности крови (колориметрически).
Для клинических целей пользуются измерением интенсивности окраски, которое требует небольшого количества крови и даёт возможность быстро определить количество гемоглобина. Наиболее распространённым является колориметрический метод Говерса в видоизменении Сали.
Определение гемоглобина по Сали основано на том, что гемоглобин крови в растворе соляной кислоты переходит в солянокислый гематин, который и сравнивается с гематином определённой концентрации, взятом в качестве стандарта. Процент гемоглобина определяется в этом случае колориметрически.
Набор Сали состоит из запаянной стандартной пробирки, наполненной раствором солянокислого гематина. Ввиду того что стандартная жидкость довольно быстро обесцвечивается, в последнее время выпущены стандарты со стеклянными палочками, окрашенными металлическими окислами под цвет солянокислого гематина. Стеклянные окрашенные стандарты удобны в том отношении, что не выцветают даже под действием прямого солнечного света.
Рядом со стандартной пробиркой в подставке помещается другая пробирка с делениями от 10 до 140, такого же диаметра, как и первая. К гемоглобинометру прилагается капилляр для взятия крови и пипетка для разведения.
Подставка гемоглобинометра Сали представляет собой деревянную колодку с вырезанными продольными отверстиями и углублениями для пробирок прибора. Сзади колодки прикреплено матовое стекло, которое даёт рассеянный свет, на фоне которого резко оттеняется окраска стандарта и испытываемой сыворотки.
Капиллярная трубка для взятия крови имеет метку— 20 мм3, которая определяет количество крови, взятой для исследования.
Рис. 29. Гемоглобинометр Сали
Для исследования гемоглобина по методу Сали необходимо иметь 7i0 71 раствор НС1 и дестиллированную воду.
Техника исследования. В градуированную пробирку до метки 20 наливается 1/1а п раствор НО. Затем в капилляр до метки 20 мм8 насасывают кровь и, осторожно очистив конец капилляра, переносят кровь в пробирку с соляной кислотой. Кровь осторожно выдувается в децинормальный раствор соляной кислоты, на дно пробирки, и затем, для удаления следов крови, содержимое пробирки из верхнего прозрачного слоя набирается в капилляр и снова выдувается в пробирку. Капилляр промывается 2—3 раза и осторожно удаляется из пробирки. Кровь гемолизируется, и при распаде образуется солянокислый гематин. Жидкость становится темноко-ричневой. Спустя 5—7 минут после выдувания крови, в пробирку начинают прибавлять дестиллированную воду. Вначале прибавляют по нескольку капель, а затем, по, мере изменения цвета и приближения его к стандарту, по одной капле. Кровь смешивается с дестиллированной водой тонкой стеклянной палочкой с шариком на конце. Необходимо следить за тем, чтобы жидкость при смешивании не терялась. Уровень жидкости после разведения указывает на количество гемоглобина. Учёт ведётся по-нижнему мениску жидкости. Определение” гемоглобина лучше проводить при дневном свете. Допустимой ошибкой, при вторичном исследовании той же самой крови, считается расхождение в пределах 5 делений. Метка 100 на гранулированый пробирке соответствует содержанию 16% гемоглобина.
С гемоглобинометром Сали сходен гемоглобинометр Мигос. По простоте обращения он превосходит Сали. Полученное в процентах число в гемоглобинометре Мигос нужно умножить на 8/10 для выявления истинного количества гемоглобина. Кровь берётся так же, как и для гемоглобинометра Сали. К аппарату приложена шкала, которая указывает, какое количество гемоглобина в граммах соответствует окраске жидкости.