Калибровочный график на гемоглобин

Общее описание

Гемоглобин, как и другие белки, находясь в растворе глюкозы, присоединяет к своей белковой части (β-концевым валином в B-цепи молекулы HbА) молекулы глюкозы за счет химических (неферментных) связей. При повышенных концентрациях глюкозы в крови она вступает в неферментативное взаимодействие с белками плазмы с образованием шиффовых оснований, в том числе с Hb. Эта реакция необратима. Количество гликозилированного белка пропорционально концентрации глюкозы и длительности инкубации. Поэтому содержание гликозилированного гемоглобина (HbА1c) в эритроцитах человека является интегральным показателем углеводного обмена за предшествующие 90-120 дней, что соответствует длительности жизни эритроцита в организме.
Измерение концентрации HbA1c позволяет ретроспективно оценивать уровень гипергликемии при сахарном диабете. Гликозилированный Hb состоит из трх компонентов: HbA1а, HbA1b и HbA1c. Из них HbA1c обладает более высокой корреляцией со степенью выраженности гипергликемии у больных сахарным диабетом. Гликолизированный гемоглобин (HbA1c) используется как показатель риска развития осложнений сахарного диабета. В соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения этот тест признан оптимальным и необходимым для контроля за качеством лечения диабета.

Гликозилированный гемоглобин, наряду с показателями гликемии, является важнейшим параметром, используемым для оценки степени компенсации углеводного обмена у больных сахарным диабетом 1-го и 2-го типа. Исследование содержания HbА1c целесообразно производить в динамике с интервалами 3-4 месяца для оценки эффективности лечебных мероприятий у больных сахарным диабетом. Содержание HbА1c не следует использовать для контроля за состоянием углеводного обмена у больных с уремией, находящихся на гемодиализе, муковисцидозом, гемолитической анемией, а также при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями синтеза мембраны эритроцитов (микросфероцитоз, талассемия). Тест на гликозилированный гемоглобин дает значительно более показательную информацию о гликемическом профиле пациента, нежели значение сахара в крови натощак.

Результаты исследования оценивают следующим образом: 4−6% — хорошая компенсация сахарного диабета в последние 1−1,5 месяца, 6,1−7,5% — удовлетворительная компенсация, более 7,5% — неудовлетворительная компенсация. Для оценки эффективности лечения целесообразно повторить исследование через 2−3 месяца.

Методами определения гликозилированного гемоглобина являются высокоэффективная жидкостная хроматография, жидкостная ионообменная хроматография, аффинная хроматография, иммунотурбидиметрия, электрофорез. Но наиболее точными являются хроматографические исследования. У практически здоровых лиц содержание HbА1c составляет 4-6% (нормальные показатели могут варьировать при использовании различных методов определения HbА1c). Материал пробы является цельная кровь, которая на анализ берется из вены в количестве 5 мл. Каких-либо особых рекомендаций перед тем, как сдать анализ крови на гликозилированный гемоглобин выполнять не требуется.

Контрольные параметры лечения сахарного диабета

Следует помнить, что дефектные формы гемоглобина могут искажать результат исследования давая как ложное повышение, так и понижение содержания его гликозилированной формы.

Подготовка к сдаче анализа

Кровь берется натощак. Это требование необходимо соблюсти, чтобы не исказить результаты. Крайний прием пища должен быть за 8-12 часов до анализа.

Как проходит процедура?

Забор крови осуществляется из локтевой вены в количестве 5 мл.

Показания для назначения анализа

• Выявление нарушенной толерантности к глюкозе;
• Нарушение метаболизма углеводов у детей;
• Сахарный диабет;
• «Скрытые» или доманифестные формы сахарного диабета;
• Диабет беременных;
• Оценка компенсации сахарного диабета;
• Эффективность лечения сахарного диабета;
• Степени риска осложнений сахарного диабета.

Расшифровка результатов анализа

Повышение концентрации HbA1c:

• сахарный диабет;
• прием лекарственных препаратов (пропранолол, гидрохлоротиазид, морфин, индапамид);
• железодефицитная анемия;
• хроническая почечная недостаточность;
• лечение гемодиализом;
• уремия;
• спленэктомия;
• повышенный уровень триглицеридов или HbF;
• алкогольная интоксикация;
• отравление солями свинца;
• тиреотоксикоз;
• болезнь Иценко-Кушинга;
• травмы и опухоли ЦНС.

Снижение концентрации HbAlc:

• длительная гипогликемия;
• восстановление крови после кровопотери;
• гемолиз;
• переливания крови;
• гемолитическая анемия;
• острые и хронические геморрагии;
• нарушение синтетической способности печени;
• недостаточное белков в пищевом рационе;
• нефротический синдром;
• гиперинсулинизм;
• гипотиреоз.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ

Проба и требование к ней: свободнотекущая капиллярная или венозная кровь; в качестве антикоагулянтов — ЭДТА, гепарин, аммоний или калий оксалаты. Проба стабильна 48 час при 4° С или 24 час при 23° С. Преаналитическая фаза Укажем на некоторые факторы, связанные с отбором пробы и составом исследуемой крови, которые обуславливают получение заведомо неправильного результата:

• при взятии капиллярной крови не допускается чрезмерное давление или выжимание крови, вызывающее выход межклеточной жидкости, которая разбавляет пробу крови и приводит к ошибочно низкой концентрации гемоглобина;
• наложение жгута на руку более, чем на одну минуту может привести к пролонгированному сосудистому стазу и ошибочно высокой концентрации гемоглобина в венозной крови;
• использование негомогенной пробы, полученной при недостаточном перемешивании;
• липимическая кровь;
• кровь, содержащая большое количество лейкоцитов.

Оборудование

• Фотоэлектрические гемоглобинометры. Приборы измеряют концентрацию гемоглобина; на дисплее сразу выдается концентрация гемоглобина в г/100 (или 1000) мл. Эти приборы прокалиброваны калибровочными растворами в зависимости от применяемого метода. Гемоглобинометры необходимо регулярно проверять и настраивать по калибровочным растворам.

К данным приборам относятся анализаторы Hemocue и МиниГем:

• Фотометры со светофильтрами. Приборы измеряют оптическую плотность; при этом необходимо использовать светофильтры, поглощающие свет вблизи l = 540 нм. Расчет концентрации гемоглобина проводится по калибраторам или калибровочному графику.

КФК-3:

• Автоматические гематологические анализаторы, например Micros (18 параметров):

Дозаторы Для дозирования трансформирующего раствора используют обычные дозаторы с погрешностью дозирования 1-3%, для крови — пипетки Сали, механические дозаторы с погрешностью дозирования не более 1,0%. Реагенты 1. Наборы реагентов для определения гемоглобина Состав наборов Определение гемоглобина гемиглобинцианидным или гемихромным методами проводят с использованием коммерческих наборов реагентов. В состав наборов входят трансформирующие реагенты и калибраторы (последние — не во все наборы). Единственным анализатором, работающим на основе метгемоглобиназидного метода, является фотометр шведской фирмы Hemocue. Система состоит из одноразовых микрокювет, содержащих сухие реагенты, и специально разработанного двухволнового фотометра. Микрокювета служит и как пипетка, и как измерительная кювета, в ней же протекает и реакция. 2. Наборы контрольных растворов гемоглобина Состав наборов Наборы контрольных растворов гемоглобина необходимы для оценки правильности определения гемоглобина и для проведения внутреннего контроля качества. Наборы содержат 3 флакона по 2 мл контрольных растворов гемоглобина с концентрацией ~ 80, 120 и 160 г/л. Растворы готовы к применению и не требуют дополнительной подготовки. Следует использовать наборы, концентрация гемоглобина в которых аттестована с погрешностью не более ± 2%. Срок годности вскрытых контрольных растворов гемоглобина не менее 3 мес. в плотно закрытом виде при температуре 2-8° С. Требования, предъявляемые к контрольным растворам гемоглобина Растворы должны быть гомогенны, не содержать сгустков крови и механических включений, хорошо очищены от липидов и других примесных соединений. Наличие этих примесей создает легкую мутность реакционной смеси и способствует завышению результатов определения гемоглобина, которое в дальнейшем приведет к неправильным результатам анализа. Определение гемоглобина в контрольных растворах проводят аналогично определению гемоглобина в крови.

Последовательность проведения операций при определении гемоглобина в крови

1. Калибровка измерительного прибора и построение калибровочного графика (необходимы только для фотометров типа КФК, ФЭК);
2. Проведение внутреннего контроля качества;
3. Проведение анализа.

Калибровка измерительного прибора и построение калибровочного графика.

Для построения калибровочных графиков желательно использовать коммерческие наборы калибровочных растворов гемиглобинцианида или гемихрома (в зависимости от используемого метода) четырех концентраций, а не одной. Калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации гемоглобина строят по 4 точкам измеренной оптической плотности, соответствующей определенной концентрации гемоглобина. График должен представлять собой прямую линию, выходящую из начала координат. Если при его построении получается кривая линия — это указывает на неисправность прибора. Полученный прямолинейный график использовать при расчете концентрации гемоглобина в пробах крови. Калибровочный график следует строить не реже 1 раза в неделю.

Проведение внутреннего контроля качества

При проведении исследований возможно возникновение различных погрешностей (систематических и случайных), связанных с ошибками операторов; приборными ошибками; неточностью пипеток; несоблюдением времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности; несоблюдением температурного режима; негомогенностью пробы и др. Эти и другие погрешности можно выявлять с помощью контрольных растворов гемоглобина, проводя внутренний контроль качества. Определение гемоглобина следует проводить с использованием точно откалиброванных пипеток. Особое внимание следует уделять истинному объему крови (20 мкл), отбираемому микропипетками, поскольку погрешность в 1 мкл при последующем разведении крови трансформирующим раствором в 251 раз дает погрешность определения гемоглобина до 5%. Систематические аппаратурные ошибки:

• — неправильная калибровка измерительного прибора (составляющая до 40% от общего числа допускаемых ошибок). Она может быть связана: с ошибками при построении калибровочного графика; ошибками при расчете фактора; использованием некачественных калибровочных растворов; нелинейностью характеристик измерительного прибора, нестабильностью прибора;
• — использование неточно откалиброванных пипеток, что приводит к ошибкам разведения, составляющим ~ 50% от общего числа ошибок;
• — неправильный выбор способа дозирования пробы.

Случайные ошибки:

• — ошибки оператора вследствие: нарушения рекомендуемого температурного режима; несоблюдения необходимого времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности; использование некачественных или неправильно приготовленных трансформирующих реагентов; неправильного измерения или расчета;
• — ошибки, связанные с неправильным отбором пробы и составом крови (см “Преаналитическая фаза”).

Вначале следует исключить возможные систематические ошибки, связанные с влиянием аппаратурного фактора, но если и тогда результат определения гемоглобина в контрольном растворе не попадает в диапазон допустимых значений, следует обратить внимание на возможность появления случайных ошибок. Так, несоблюдение температурного режима (использование контрольных, калибровочных или трансформирующего раствора, недоведенных до комнатной температуры (18-25° С), может приводить как к заниженным, так и к завышенным результатам). Несоблюдение времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности занижает результаты, так как оптическая плотность будет ниже максимальной. Использование трансформирующих реагентов, не отвечающих требованиям, изложенным выше, приводит к снижению результатов, так как возможна неполная трансформация гемоглобина в гемиглобинцианид или гемихром. При правильном определении гемоглобина в контрольных растворах можно приступать к определению его в крови.

Как нормализировать значения Hb?

Пациентам с анемиями могут назначаться препараты Fe, фолиевой кислоты, витамина В12, стимуляторы эритропоэза, специальная диета (увеличенное потребление сухофруктов, мяса, шоколада, орехов и т.д.)

При тяжелых анемиях может потребоваться переливание крови.

Пациентам с хроническими постгеморрагическими анемиями следует устранить причину кровотечения (язва, длительные менструации, геморрой, ломкость капилляров и т.д.).

Исследование на гемоглобин — один из самых распространенных анализов крови, его может назначить врач любой специализации — от терапевта до иммунолога. Но почему же этот анализ считается таким универсальным? Какую информацию результаты могут сообщить доктору? Чем чреваты колебания уровня гемоглобина в крови у взрослых и детей? Обо всем этом — в нашей статье.

( 2 оценки, среднее 4 из 5 )