Методы лабораторного исследования гемоглобина
26 февраля 2019 г.
Гемоглобин (Hb) – молекула, с помощью которой переносится кислород. Она расположена внутри зрелых эритроцитов, лишенных ядер. Клетки получают кислород из альвеол легких, переносят его органам к клеткам-мишеням. От них получают углекислый газ, и переносят его обратно в легочную систему. Без этого действия невозможна жизнь человека. Существуют различные состояния, при которых гемоглобин может повышаться или снижаться. Для диагностики используют различные лабораторные методы определения функции соединения гемоглобина. Их подбирает врач индивидуально для каждого пациента.
Клиническое значение определения гемоглобина
У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:
- женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
- мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.
Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.
Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
- недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B12);
- заболевание красного костного мозга.
Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
- компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
- снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.
Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.
Методы измерения гемоглобина в крови
Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:
- гемиглобинцианидный;
- гемихромный;
- Сали;
- аммиачный;
После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.
Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.
Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.
Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи
Унифицированные методы определения гемоглобина
Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.
Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.
Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови
У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.
Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.
Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).
Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.
Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!
Гемихромный метод определения гемоглобина в крови
С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).
Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.
Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.
Цианидный метод исследования гемоглобина в крови
Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.
В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.
Метод Сали для определения гемоглобина в крови
Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.
Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).
На нижнем мениске пробирки будет стоять цифра, которая указывает на содержание показателя в 100 г крови. Для вычисления концентрации в 1 литре, показатели умножают на 10. Процентное содержание Hb вычисляется с помощью пропорции:
16,7%=100
- А%=Х
- Х=А×100/16,7
- Х – определяемый показатель,
- А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
- 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.
Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина
Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:
- Оксигемоглобин;
- Дезоксигемоглобин;
- Карбоксигемоглобин;
- Метгемоглобин.
Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.
Аммиачный метод определения гемоглобина
Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.
Методы определения гемоглобина в моче
Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.
- Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
- Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
- Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
- Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.
Какой метод определения гемоглобина наиболее точный?
Наиболее точным методом определения показателя считается фотоколориметрический с использованием гемихромного разведения. С помощью него снижается риск врачебной ошибки. Прибор автоматически подсчитывает показатель. Здесь важно правильно подготовить приборы, пробирки, кюветы, настроить аппарат. Методика безопасна для лаборанта.
В определении Hb в моче наиболее информативным является использование тест-полосок. Здесь полностью исключается риск неправильного разведения реактивов.
Определение гемоглобина является важным информативным тестом. Можно определить кровотечение в мочевыводящих путях, состояние сердечно-сосудистой и легочной системы. С помощью методов вовремя выявляются различные виды анемии при низких концентрациях гемоглобина. После получения данных рекомендуется обратиться к лечащему врачу. Он расшифрует полученный результат, выявит нормы и отклонения, назначит лечение.
Узнай о методах определения гликозилированного гемоглобина в крови!
Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro
Полезное видео
Подсчет лимфоцитов: разновидности метода
Подсчет количества тромбоцитов в крови – подробно о методиках
Откуда лучше брать общий анализ крови – пальца или вены?
Подсчет количества эритроцитов: выбор лучшей методики
Методы определения содержания гемоглобина в крови разнятся между собой. Их особенности зависят от реактива, который используется в лабораториях, безопасности исследования, его точности и скорости. По результатам анализов проходит диагностика.
Клиническое значение определения гемоглобина
Гемоглобин образуется в эритроцитах. Делая вдох, кровяные тельца насыщаются кислородом. Через них белок по крови «доставляет» кислород в ткани, а затем, возвращаясь, углекислый газ попадает в легкие. Именно Hb в какой-то мере отвечает за такую важную функцию, как дыхание.
У взрослого человека значения гемоглобина зависят от пола. У женщин концентрация клеток ниже, так как их мышечная масса обычно меньше:
- 12-16 г/% или 120-160 г/л для мужчин;
- 11-14г/% или 110-140 г/л для женщин.
Эти показатели являются нормой. Их изменения в большую или меньшую сторон говорит о заболевании. Во время беременности или в пожилом возрасте показатели могут снижаться. Если понижение не связано с этими факторами, врачи часто диагностируют:
- железодефицитная, серповидно-клеточная анемия, которая приводит к уменьшению эритроцитов;
- недостаток фолиевой кислоты или витамина В12;
- болезни красного костного мозга.
Повышение гемоглобина тоже ведет за собой плохие последствия. Часто симптом связан с рядом проблем:
- злокачественные новообразования, болезни красного костного мозга;
- увеличение числа эритроцитов в связи с сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
- уменьшение плазмы крови.
Гемоглобин образуется в эритроцитах после того, как пропадает ядро или приобретения клетки зрелости. Селезенка утилизирует красные кровяные тельца и Hb. 1 клетка живет 4 месяца. После того, как она погибает, в крови образуется железо. Оно попадает в красный костный мозг. С его помощью появляются новые красные кровяные клетки.
Методы измерения гемоглобина в крови
Определение концентрации гемоглобина возможно с помощью нескольких методов. Hb измеряют еще и в моче, так как в мочевыводительной системе бывают кровотечения (как незначительные, так и обильные).
Различают несколько основных форм гемоглобина:
- оксигемоглобин;
- карбоксигемоглобин;
- дезоксигемоглобин.
Для анализа все формы Hb с помощью реактивов делают одинаковыми, чтобы их мог считать прибор. После применения определенной методики, используют полуавтоматический анализатор. С его помощью измеряют спектр длины волны молекулы гемоглобина.
Внимание!
Такой анализатор исключает возможность реставрации ошибки врача в отчете необходимого значения. Аппарат также не способен увидеть и распознать различные нарушения в параметрах.
Ручной подсчет применяется с реактивом и биолоатериала. Такой способ не считает количество клеток, а определяет их присутствие в жидкости. Часто используют для анализа мочи.
Унифицированные методы определения гемоглобина
Исследование является точный, быстрым и используется в большинстве лабораторий. Для Hb подходит гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Метод основывается на определении точного числа клеток при помощи подсчета длины волны молекулы на специальном полуавтоматическом приборе.
Другой способ — гимехромный. Проводится также, однако для него используются более качественные реактивы, которые не вредят здоровью исследователя. Метод является более щадящим и применяется чаще первого.
Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови
Определить длину Hb сложно, так как он имеет много разных форм. Для упрощения процесса и более точных результатов его превращают в метгемоблогин. Делается это с помощью специальных химических веществ.
Чтобы правильно провести анализ необходим трансформирующий раствор, измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Длина волны гемоглобина составляет 540 м. В таком пределе аппарат определяет нужный показатель. Полученный результат высчитывается по формуле и переводится в значение граммы на литры.
Этот метод одобрен Комитетом здравоохранения из-за того, что он является максимально точным. Он имеет много положительных сторон:
- дешевизна реактивов, которая не требует от медицинского учреждения большого бюджета;
- простата в проведении: даже студент-лаборант сможет провести процедуру;
- скорость анализа;
- использование полуавтоматического анализатора, что исключает врачебную ошибку в подсчетах.
Несмотря на все плюсы, методику считают устарелой. У нее есть ряд серьезных недостатков:
- используемые вещества опасны для здоровья врача: при неправильной эксплуатации возможны поражение слизистых, кожи, дыхательных путей;
- наличие современных и полностью безопасных методов работы;
- врачебная ошибка возможна на этапе выбора дозировки реактивов.
Внимание!
Метод проводится с использованием цианидных компонентов, что является опасным для здоровья врачей химикатом.
Гемиглобинцианидный способ исследования -точный анализ, который применялся раннее в каждом лаборатории. Сейчас же на смену ему пришли более современные методы.
Гемихромный метод определения гемоглобина в крови
Здесь клетки Hb переводят в форму гемихрома (HbChr). Его легко удается подсчитать. По полученному числу врачи определяют концентрацию гемоглобина в биоматериале. Методика имеет множество плюсов:
- 2 варианта забора материала: капилярная крови или венозная;
- скорость исследования. Результаты будут готовы в день сдачи;
- безопасность для сотрудников, так как при анализе не используются опасные для здоровья вещества;
- полуавтоматический анализатор, который используют для подсчета количества клеток. Исключает врачебную ошибку;
- простота метода и цена используемых реактивов;
- высокая точность показателей, на основе которых врач делает выводы о состоянии пациента;
- использование небольшого количества крови. Если результаты показались сомнительными, анализ всегда можно сделать повторно.
Исследование полностью безопасно, но и у него есть ряд минусов. Делая выводы по поводу диагноза, специалист всегда должен помнить о недостатках методики:
- ошибки при сборе крови;
- неправильная концентрация реактивов или их неверное подготовление;
- размер клеток и их форму рассмотреть невозможно, так как фотометр лишь подсчитывает их количество.
Гемихромный метод используется врачами довольно часто для постановки диагноза больному. Он точен, безопасен и не затратен для больницы, поэтому очень популярен при анализе крови.
Цианидный метод исследования гемоглобина в крови
В капиллярную или венозную крови добавляется трансформирующий раствор. С его помощью образуется метгемоглобин.
Внимание!
Цианид — опасное вещество, которое может навредить здоровью врачей-лаборантов. Поэтому метод является опасным и практически не проводится в медицинских учреждениях.
В пробирке смешивают 5 мл реагента и 20 мл биоматериала. В течение 10 минут происходит реакция. Жидкость выливают в специальный сосуд, через который фотоэлектроколориметр пропускает лучи. Он подсчитывает количество элементов, длина которых составляет 543 нм. Содержание гемоглобина высчитывается далее по формуле.
Метод сали для определения гемоглобина в крови
Анализ основывается на визуальном определении содержания гемоглобина, то есть на колориметрии. Это делают при сравнении окраски исследуемого материала с раствором солянокислого гематина.
В кровь человека добавляют хлористоводородную кислоту. Благодаря этому Hb переходит в форму солянокислого гематина. В раствор далее наливают дистиллированную воду (до тех пор, пока цвет не будет таким же коричневым, как в контрольной пробирке). Для сравнения используют специальный колориметрический аппарат.
Снизу пробирки будет цифра, которая показывает содержание показателя в 100г крови. Чтобы выделить количество клеток в литре, результат умножают на 10. Далее врач рассчитывает результаты по формуле.
Метод имеет погрешность в 30%, что делает его недостаточно точным для постановки диагноза больному. Из-за этого лаборанты применяют его в работе редко.
Читайте также
Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина
Использование спектофотометра гарантирует максимальную точность результатов исследования. Для выявления гемоглобина, необходимо перевести клетки в единую форму, так как прибор может улавливать только одну из его форм. Для этой цели берут различные реактивы.
Нужные элементы окрашивают (в красный или зеленый цвет), потом аппарат в выбранном диапазоне вылавливает длину волны клеток и подсчитывает их.
Аммиачный метод определения гемоглобина
Проведение исследования проходит по тому же принципу, что и в других методах. Главное отличие состоит в использовании аммиака в концентрации 0,04.
Сначала проба настаивается какое-то время, чтобы гемоглобин перешел в одну форму. Далее ее подсчитывает прибор — полуавтоматический анализатор спектрофометр. Раствор переливают в пробирку под лучи аппарата. Он выделяет волны длинною в 543 нанометров.
Цианметгемоглобиновый метод
Еще один анализ, который считается наиболее точным. Он основывается на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин после добавления в биологической жидкости химическое вещество.
Реактивом выступает раствор Драбкина. Соотношение биоматериала и реагента: 2:500. Через полчаса от начала процедуры замеряют клетки длиной в 550 нм, а также уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.
Полученные растворы сравнивают по цвету при помощи колометрии. По итогу лаборанты рисуют таблицы и узнают о количестве железосодержащего пептидного соединения в кровотоке.
Исследование мочи
Мочу возможно обследовать 4 способами. Биоматериал используют только свежий. Гемоглобин в настоявшейся урине превращается в метгемоглобин и реакция не получится.
Внимание!
Чтобы подготовить материал к анализу, в него добавляют 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.
Для проведения исследования возможно несколько вариантов. Выбирают его в зависимости от условий проведений исследования:
- гваяковая кислота. Щепотку вещества разводят и добавляют 3 мл этанола 96%. 8-10 капель раствора наливают в такому же количеству мочи. При наличии там Hb, жидкость окрасится в синий цвет;
- амидопирин. В 2-3 мл урины добавляют 10 капель амидопирина и столько же перекиси водорода 3%. Раствор станет фиолетовым, если в нем есть гемоглобин;
- бензидит. В емкости смешивают 6 капель бензидита и перекиси водорода 3% с 4 каплями мочи. При положительном результате раствор станет зеленым;
- тест-полоски, таблетки. Подходит для домашнего самостоятельного анализа. В них уже содержится специальный раствор реактивов. Полоску опускают в небольшое количество мочи, происходит реакция. По цвету определяются результаты. Таблетки просто растворяются в биоматериале. Индикаторная шкала всегда прописана на самой упаковке, поэтому с определением показателей справится любой человек.
Определения гемоглобина в моче наиболее целесообразно для быстрого домашнего обследования. Другие методы используются и в лабораториях.
Профилактика
Повышение или понижения уровня гемоглобина означает проблемы со здоровьем и различные серьезные заболевания. Чтобы избежать этого, придерживайтесь ряда правил:
- своевременная сдача крови. Хотя бы раз в год необходимо проводить плановый анализ, который поможет следить за уровнем Hb;
- отказ от курения. Табачный дым, который вдыхает человек, связывает гемоглобин с угарным газом, что снижает способность белка доставлять кислород в клетки организма;
- полноценное питание. Проблемы с гемоглобином могут возникнуть из-за строгих диет. Продукты, богатые белком (мясо, рыба, яйца, творог, сыр) способствуют профилактике анемии. Рекомендуется увеличить потребление продуктов, богатых железом — овсянки, пшена, гречневой каши;
- при болезнях ЖКТ внимательно следите за здоровьем, так как в периоды обострения возможны кровотечения. Это снижает уровень Hb в крови.
Читайте также
От гемоглобина во многом зависит общее состояние человека. Анализ на определения его уровня — один из главных и плановых ежегодных исследований, так как белок отвечает за важную функцию — поставку кислорода в клетки организма. Hb включен в процесс дыхания и доставки углекислого газа и в легкие, с помощью которого мы живем. Поэтому необходимо следить за показателями и сверять их с цифрами нормы для вашего пола и возраста.