Набор для диагностики инфекционной анемии лошадей

3. Компоненты, входящие в состав набора (антиген, антисыворотка, кислота борная, рас­твор натрия гидроокиси, агар «Дифко»), расфасованы во флаконы вместимостью 10 см3, герме­тично укупоренные резиновыми пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками. Компо­ненты, представленные в лиофилизированном виде (антиген, антисыворотка), после добавле­ния дистиллированной воды растворяется в течение 3-5 минут.

4. Флаконы с компонентами, входящими в состав диагностического набора, уложены в коробки пенополистирольные с гнёздами или картонные коробки с разделительными перего­родками, обеспечивающими их целостность. В каждую коробку вкладывают инструкцию но применению диагностического набора.

5. Срок годности набора – 24 месяца с даты выпуска при соблюдении условий хранения и транспортирования. По истечении срока годности набор к применению не пригоден.

Антиген и антисыворотку, неиспользованные в день растворения, сохраняют в заморо­женном состоянии при температуре минус 10 °С до повторного исследования. Повторное замо­раживание сыворотки не допускается.

6. Диагностический набор транспортируют и хранят в сухом темном месте при температуре от 2 °С до 8 °С.

Допускается транспортирование набора при температуре до 20 °С не более 5 суток.

7. Диагностический набор следует хранить в местах, недоступных для детей.

8. Флаконы с компонентами набора без маркировки, с нарушением целостности и/или герметичности укупорки, с измененным цветом и/или консистенцией, с наличием посторонних примесей, с истекшим сроком годности, бракуют, обеззараживают путем кипячения в течение 30 минут и утилизируют.

Утилизация обеззараженных компонентов диагностического набора не требует соблю­дения специальных мер предосторожности.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

9. Антиген (экстракт гомогената селезёнки) содержит внутренний структурный белок вируса с молекулярной массой g 26. Он относится к так называемым растворимым антигенам, способным диффундировать в агаровом геле. Является общим (группоспецифическим антиге­ном) для всех штаммов вируса инфекционной анемии лошадей (ИНАН).

10. Принцип метода основан на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и растворимого антигена в агаровом геле. При наличии в исследуемой сыворотке антител гомо­логичных антигену образуется полоса преципитации.

11. Набор применяют для лабораторной диагностики инфекционной анемии лошадей с целью обнаружения специфических антител в сыворотках крови лошадей больных инфекцион­ной анемией.

12. Специфические антитела появляются в крови животных через 2-6 недель после ин­фицирования и сохраняются на протяжении длительного времени (более 7 лет).

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

13. Диагностический набор применяют для исследования сывороток крови лошадей на выявление антител к вирусу инфекционной анемии при остром, хроническом и латентном те­чении болезни. Набор рассчитан на исследование 90-120 проб сывороток крови.

14. Антиген и антисыворотка, имеющиеся в наборе, используются в качестве тест-системы «антиген-антитело» при постановке реакции.

15. Перед постановкой реакции сухие антиген и антисыворотку растворяют дистиллированной водой в объёме, указанном на этикетке (приготовленные разведения являются рабочими разведениями). Антиген и антисыворотка должны полностью раствориться в течение 3- 5 минут без образования не разбивающихся при встряхивании хлопьев.

16. Испытуемые сыворотки получают от исследуемых лошадей в количестве не менее 5-6 см3. Их консервируют путём добавления антибиотиков – пенициллина и стрептомицина по 1000 ЕД/мл и хранят при температуре от 4 до 8 °С в течение 10 суток. Сыворотки без кон­серванта сохраняют в замороженном состоянии.

17. Для приготовления 1% геля агара «Дифко» в стеклянную колбу вместимостью 250- 300 см3 отмеряют 140 см3 воды дистиллированной и, затем, в неё последовательно вносят кислоту борную и раствор натрия гидроокиси 3%. Содержимое колбы перемешивают до пол­ного растворения борной кислоты. Проверяют pH буфера. Буфер должен иметь pH в пределах 8,6±0,1.

В приготовленный боратный буфер вносят агар «Дифко» – 1.5 г. Колбу ставят в баню с водой, воду доводят до кипения и выдерживают в бане до полного рас плавления агара. В чашки Петри диаметром 15 см вносят 15 см3 расплавленного агара, предварительно охладив его до 60 °С. Чашки оставляют на один час с приоткрытыми крышками и дают ему застыть.

18. Контроль качества агара проводят визуально, после его застывания. Слой агара дол­жен быть ровным по всей поверхности чашки, без пузырьков газа. Толщина слоя 3 мм.

После застывания агара приступают к вырезанию лунок. Для этого используют специ­ально изготовленные пробойники из семи жестко закрепленных трубочек диаметром: 7 мм – одна в центре и шесть по окружности на расстоянии 3 мм от центральной и друг от друга.

Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединённой с вакуумной установкой. Если в лунках накапливается влага, то её перед внесением реагентов отсасывают пипеткой.

19. Постановка реакции.

Используют две схемы заполнения лунок. Первая – в центральную лунку вносят микропипеткой 0,05-0,06 см3 антигена в три периферические лунки, через одну, закапывают по 0,05-0,06 см3 антисыворотку в рабочих разведениях. Оставшиеся три свободные лунки запол­няют с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки исследуемыми сыворотками. При этом: в одной чашке исследуются 12 проб сыворотки.

20. В случае проведения массовых исследований может быть использована вторая схема заполнения лунок, которая позволяет в одной чашке одновременно исследовать 16 проб. В центральную лунку вносят антиген, в две периферические, диаметрально противоположные лунки вносят антисыворотку и оставшиеся четыре лунки – испытуемые сыворотки.

Для каждой пробы сыворотки используют отдельную пастеровскую пипетку. По­сле заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температуре от 18 до 25 °С.

21. Учёт реакции.

Реакцию учитывают через 48-72 часа. Чашки просматривают на тёмном фоне в косо направленном пучке света. Для этой цели используют осветитель ОИ-19 или другой анало­гичный прибор.

Оценку реакции делают по контрольной линии преципитации — линии преципитации между контрольными антигеном и антисывороткой. Если она отсутствует или слабо выра­жена, то исследование необходимо повторить. Контрольные линии преципитации должны быть чёткими, располагаться посредине между лунками с антигеном и сывороткой.

22. Существенный сдвиг контрольных линий преципитации в сторону антигена или сы­воротки, а также если она слабо выражена, является показателем слабой активности одного или обоих компонентов набора. В этом случае проводят подтитровку антигена и сыворотки. Для этого сухой препарат антиген или антисыворотку разводят в два раза меньшем объёме дистиллированной воды, затем готовят разведения 1:1,25; 1:1,5; 1:1,75 и проверяют в РДП. За рабочее разведение принимают то разведение компонентов диагностикума, которое даёт чёт­кие линии преципитации, расположенные посредине между лунками с антигеном и антисывороткой.

23. Оценка результатов реакции:

Отрицательная – контрольные линии продолжаются в сторону лунки с испытуемой сы­вороткой без изгибов или с небольшим изгибом в сторону контрольной сыворотки.

Положительная:

– между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном образуется полоса преципита­ции, которая соединяется с контрольной линией;

– линия преципитации отсутствует, но контрольные линии образуют вблизи с испыту­емой сывороткой изгиб, направленный в сторону антигена – слабоположительная сыворотка;

– контрольные линии укорачиваются со стороны лунки с испытуемой сывороткой, в отдельных случаях контрольные линии полностью растворяются, что свидетельствует о вы­соком титре антител. Более различимые линии преципи­тации будут образовываться, если эти пробы развести 1:4 или 1:8 и повторить реакцию.

Сомнительная – слабый изгиб контрольной линии плохо просматривается, образуются интенсивные неспецифические линии или ореол вокруг лунок, что затрудняет учёт реакции.

От животных, давших сомнительную реакцию, через 2-3 недели берут кровь и исследование повторяют.

Пробы сыворотки, давшие при повторном исследовании отрицательный результат, счи­тают отрицательными.

При получении повторной сомнительной реакции – результат считают положитель­ным.

Неспецифическая преципитация – образуется с некоторыми пробами сыворотки, особенно полученными от старых лошадей. Признаком неспецифической реакции является пере­крещивание линий преципитации с контрольными линиями.

В одной и той же пробе сыворотки могут быть специфические и неспецифические ан­титела.

24. При образовании интенсивного ореола вокруг лунок, затрудняющего учёт реакции, эти пробы сыворотки исследуют повторно, добавив к агару 5% хлористого натрия. Для этого к 150 мл боратного буфера добавляют 7,5 граммов химически чистого хлористого натрия.

25. Жеребят, полученных от положительно реагирующих в РДП кобыл, исследуют по­сле отъёма в возрасте 6-8 месяцев.

26. Результаты учёта реакции регистрируют в специальных журналах, которые должны быть прошнурованы, пронумерованы и скреплены печатью.

Диагностические препараты
 

Диагностические препараты