Тест на фетальный гемоглобин

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Согласно данным медицинской статистики, с начала столетия и по настоящее время заболеваемость туберкулезом в России очень медленно, но неуклонно снижается. Тем не менее, несмотря на успехи последних десятилетий в области фтизиатрии и государственных программ по предупреждению данной патологии, туберкулез остается одной из актуальнейших проблем социального характера, ежегодно приводящей к длительной нетрудоспособности и инвалидизации десятки тысяч граждан нашей страны. Следует отметить, что самая распространенная форма этого заболевания – туберкулез легких, традиционно поражает преимущественно самые трудоспособные слои населения – лиц молодого и зрелого возраста, демографическую основу российских народов, приводя, в масштабах страны, как к ухудшению здоровья популяции, так и к существенным экономическим потерям. В этом свете острая проблема борьбы с туберкулезом является не только медицинской, но и общегосударственной задачей [1-3].

В решении проблемы туберкулеза в нашей стране значительную роль играют федеральные программы, направленные на медленный, но неуклонный рост благосостояния среднего россиянина, улучшение общей ситуации в сфере здравоохранения, профилактические меры, регулярное медицинское обследование населения, пропаганду здорового образа жизни и др. Однако, несмотря на это, даже в XXI веке заболеваемость туберкулезом остается пугающе высокой. Объясняется это тем, что, во-первых, даже ежегодная плановая диспансеризация не в силах охватить все слои населения, во-вторых, методы современного скрининг-обследования (флюорография и др.) не способны выявить данную патологию на стадии активации процесса, когда поражения в легочной ткани еще не носят манифестного характера. Именно недостатки на этапе ранней диагностики туберкулеза являются одной из основных причин, препятствующих эффективному решению описываемой проблемы [1; 2; 4].

В свете вышесказанного поиск нового неспецифического маркера туберкулезного процесса и создание соответственного лабораторного теста, способного дополнить общепринятую диагностическую панель по данной нозологии и тем самым улучшить своевременное выявление туберкулеза на самых ранних стадиях заболевания, является актуальной задачей современной медицины.

Высокий интерес в этом смысле представляет фетальный (плодовый) гемоглобин человека (HbF). Этот гемсодержащий мультимер построен из двух α- и двух γ-цепей. pI – 6,9-7,15. Его продукция активируется с 12-13-й недели гестации, и к моменту рождения его концентрация в крови составляет 55-85% от общего гемоглобина. У взрослого на долю HbF приходится около 1,5% от общего гемоглобина [5-7].

Исходя из литературных данных последних лет, доказывающих диагностическую значимость иммунохимического теста на фетальный гемоглобин, как надежный маркер хронической гипоксии различного генеза [8-10], авторами было сделано предположение, что изменение продукции этого протеина вполне вероятно при туберкулезном процессе легких, зачастую сопровождающемся хроническими гипоксемическими явлениями.

Цель исследования: разработка нового иммунохимического теста на фетальный гемоглобин для оценки тяжести поражения легких, определения прогноза, мониторинга лечения туберкулеза легких и анализ его диагностической значимости.

Материалы и методы исследования

Настоящее исследование проведено в период с 2015 по 2017 г. В качестве клинического материала использовалась гемолизированная кровь больных туберкулезом легких и здоровых доноров (контрольная группа) общей численностью 471 образец, взятый от 287 человек (табл. 1). Материал получали в ГБУЗ АО «Областной клинический противотуберкулезный стационар» и на Астраханской областной станции переливания крови.

Таблица 1

Перечень использованного в работе материала

Клинический анализ форм данной нозологии проводился при участии квалифицированных фтизиатров.

Для оценки сатурации крови использовали пульсоксиметр.

Для очистки препарата HbF использовали методы термически-механического гемолиза, щелочного осаждения (поэтапная обработка биоматериала раствором сульфата аммония 50% насыщенности и 1,25 М раствором NaOH с дальнейшей седиментацией при 6000 g), электрофоретического фракционирования в агаровом геле на 0,15 М цитратном буфере с рН 6,2 (в авторской модификации), электрофореза в полиакриламидном геле, ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50 и гель-проникающей хроматографии на сефадексе G-200. Антисыворотки получали путем иммунизации кроликов малыми дозами очищенного препарата HbF с полным адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. Для количественного анализа общего гемоглобина в исследуемых пробах применяли унифицированный гемоглобинцианидный метод.

Для селективной количественной регистрации фетального гемоглобина в исследуемых образцах использовали разработанный и запатентованный ранее метод ракетного электрофореза в агаровом геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) [11; 12].

При анализе диагностической значимости предлагаемого теста на HbF референтная оценка носила альтернативный характер, а изучаемый тест давал количественный результат. В этом случае использовали точку разделения (дискриминантную концентрацию), превышение которой считается достаточным основанием для качественной оценки. Числовое значение точки разделения по каждому показателю выбирали как сумму (или разницу, в зависимости от вектора отклонения исследуемого признака при данной патологии) среднего значения изучаемого белка в группе контроля и четырехкратного среднеквадратического отклонения (М±4σ). Нормальным считалась концентрация, не превышающая дискриминантный уровень. Повышенным считали показатель, который более чем на 10% превышал точку разделения. При таком подходе количественный результат оценивался так же, как альтернативный.

Для математического анализа и оценки статистической значимости полученных результатов использовали лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2016 (Microsoft) и Statistica 6.0 (Stat Soft, Inc., США). Вычисляли средние величины (М) в каждой выборке, средние ошибки средней арифметической (m). С целью определения значимости р различий сопоставляемых средних величин применяли критерий t Стьюдента с поправкой Бонферрони и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различия считали достоверными при р < 0,05. Для анализа зависимости между сравниваемыми группами проводили линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции – r). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины r к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивали применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики.

Результаты исследования и их обсуждение

Данное исследование являлось закономерным продолжением проведенной ранее работы, в ходе которой был оптимизирован способ выделения HbF, получены моновалентные антисыворотки на этот белок, смоделирована соответствующая иммунохимическая тест-система (в которой тест-антигеном являлся гемолизат пуповинной крови новорожденных в разведении: 1/128, порог чувствительности тест-системы – 2,23±0,25 мг/л (р<0,005)). Для количественного анализа HbF разработан способ ракетного электрофореза в агаровом геле с ДСН, отличающийся абсолютной специфичностью определения HbF, точностью (максимальная погрешность ±2,1%), высокой чувствительностью (порог чувствительности – 1,71±0,26 мг/л), значимостью регистрации, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (F=8,2; р<0,01). Корреляционный анализ показал высокую прямую зависимость концентрации исследуемого белка от квадрата диаметра кольца преципитации (r=0,94; p<0,001). Широкая клиническая апробация теста показала высокую значимость фетального гемоглобина как неспецифического маркера хронической гипоксии [7; 11].

При трактовке полученных данных в настоящей работе возникала проблема выбора подходов к оценке концентрации HbF. Дело в том, что у значительной доли пациентов (23%) исследуемой выборки отмечалась анемия различной степени выраженности. Следовательно, анализ уровня фетального гемоглобина по абсолютным величинам (г/л) был невозможен, т.к. уровни общего гемоглобина у разных пациентов (с анемией и без) значительно различались, то не исключались варианты, при которых видимое изменение концентрации HbF фактически могло оказаться недостоверным в силу пропорционального изменения уровня общего гемоглобина.

Поэтому, для максимальной верификации полученных результатов по фетальному гемоглобину, в тех же выборках нами было проведено конвертирование абсолютных величин концентрации (г/л), полученных в ходе иммунохимического исследования, в относительные величины – процент HbF от общего гемоглобина в каждой нозологической группе. Полученные данные (в %) в целом адекватно соотносились с результатами определения изучаемого белка.

Проведен количественный иммунохимический анализ HbF методом ракетного электрофореза с ДСН в представленных клинических группах (табл. 2).

Таблица 2

Результаты иммунохимического определения HbF в исследуемых группах

Как видно из таблицы 2, показаны высокие уровни обратной корреляции между средними концентрациями HbF и средними показателями сатурации крови во всех клинических выборках, что доказывает значимость HbF как маркера гипоксии.

Анализ дисперсии по клиническим формам и различия между парными выборками (контрольная группа и пациенты с соответствующей патологией) оказались статистически значимыми во всех группах:

• очаговая форма туберкулеза легких: коэффициент Стьюдента t=3,97; доверительная вероятность ошибки (р) < 0,05; коэффициент дисперсии F=4,9;
• инфильтративная форма: t=4,22; р<0,05; F=5,3;
• диссеминированная форма: t=5,34; р<0,01; F=5,7;
• фиброзно-кавернозная форма: t=4,42; р<0,05; F=5,4;
• послеоперационные реконвалесценты: t=4,42; р<0,05; F=5,4.

Различия уровней HbF у больных и здоровых в целом оказались достоверными (р<0,01), так же как и между пациентами с различными формами туберкулеза (р<0,05).

На наш взгляд, активация продукции HbF у больных с туберкулезом легких является компенсаторной реакцией на гипоксемические изменения и объясняется пролиферацией клона эритробластов, способных к синтезу HbF. Можно предположить, что главным фактором, регулирующим эритропоэз, должно быть отношение между снабжением тканей кислородом и их потребностью в этом газе. Вероятно, что метаболические изменения, касающиеся латентной или явной декомпенсации процессов газоснабжения тканей у туберкулезных больных, создают то микроокружение эритроидных клеток, которое влияет на их программирование с преимущественным образованием фетального гемоглобина.

Был также проведен количественный иммунохимический анализ фетального гемоглобина крови в клинических выборках в динамике (во временном диапазоне с момента поступления пациента в стационар по 12-й месяц терапии включительно). Данное исследование показало довольно низкие (на грани достоверности) корреляционные связи между уровнем HbF и сроками терапии патологического процесса:

• очаговая форма: коэффициент Пирсона (r) = -0,43 (р<0,05);
• инфильтративная форма: r = -0,51 (р<0,05);
• диссеминированная форма: r = -0,63 (р<0,05);
• фиброзно-кавернозная форма: r = -0,34 (р<0,05).

Очевидно, слабые, невыраженные тенденции к нормализации уровня HbF в процессе лечения исследуемых групп патологии объясняются тем, что, в соответствии со спецификой нозологии, противотуберкулезная терапия отличается длительностью и далеко не всегда дает быстрый позитивный результат.

Исключение составила группа пациентов, перенесших оперативное вмешательство по удалению очага поражения (туберкулема, инфильтрат и др.). В этой выборке была показана высокая обратная корреляция между средними показателями HbF и сроком послеоперационной реабилитации (r = -0,85). Данный факт можно объяснить нормализацией процессов тканевого дыхания в результате успешного хирургического лечения.

На последнем этапе работы была проведена оценка диагностической значимости (ДЗ) разработанного иммунохимического теста на фетальный гемоглобин по всем критериям этого показателя: диагностической чувствительности, диагностической специфичности, прогностичности положительного и отрицательного результатов, диагностической эффективности.

Поскольку иммунохимический тест на фетальный гемоглобин давал количественные результаты, а его оценка носила альтернативный характер (см. выше), вычисленная точка разделения по относительной концентрации HbF была равна 1,77% от общего гемоглобина.

Анализ показателей качества предлагаемого теста на HbF, как диагностического инструмента при туберкулезе легких, дал высокие результаты:

• чувствительность теста – 93,3%;
• специфичность – 100%;
• прогностичность положительного результата – 100%;
• прогностичность отрицательного результата – 86,2%;
• диагностическая эффективность – 96,7%.

Как показал анализ ДЗ, иммунохимический тест на HbF имеет абсолютные показатели специфичности, высокие значения диагностической эффективности и прогностичности положительного результата, что является несомненным преимуществом теста и объясняется полным отсутствием ложноположительных результатов при его применении.

Заключение

Клиническая апробация разработанного иммунохимического теста на фетальный гемоглобин показала его состоятельность. Учитывая полную специфичность и высокую диагностическую эффективность предлагаемого теста, можно заключить, что его широкое внедрение в клиническую практику, безусловно, эффективно дополнит общепринятую диагностическую панель туберкулеза легких.

Библиографическая ссылка

Кривенцев Ю.А., Гудинская Н.И., Кривенцева М.Ю., Носков А.И. НОВЫЙ ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ НА ФЕТАЛЬНЫЙ ГЕМОГЛОБИН В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 3.;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=27657 (дата обращения: 29.10.2020).

Источник