Временные методические указания по диагностике инфекционной анемии лошадей

Временные методические указания по лабораторной диагностике инфекционной анемии лошадей.(Утверждены 25 марта 1983 г.)
1. Общие положения.
1.1. Инфекционная анемия лошадей – вирусная болезнь однокопытных животных, характеризующаяся рецидивирующей лихорадкой, анемией, а также бессимптомным вирусоносительством.
1.2. Лабораторный диагноз на инфекционную анемию устанавливают на основании результатов серологических (РДП), гематологических и патоморфологических исследований.
В сомнительных случаях для проверки особо ценных лошадей ставят биологическую пробу. При исследовании сывороток лошадей – продуцентов ставят групповую биопробу.
2. Взятие материала.
2.1. Для исследования в ветеринарную лабораторию доставляют: сыворотку крови лошадей (5-6 мл) для серологического исследования; кровь (10-12 мл), стабилизированную 20%-ным раствором лимоннокислого натрия, для гематологического исследования (кровь берут до поения и кормления животного); кусочки печени, селезенки, почек, сердца, легких и лимфатических узлов, взятых от павших или убитых с диагностической целью животных для гистологического исследования.
2.2. Сыворотку крови или дефибринированную кровь от подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей для постановки биопробы берут, как указано в п.6.
3. Серологическое исследование.
3.1. Серологический метод диагностики инфекционной анемии основан на обнаружении антител к вирусу этой болезни в сыворотке крови подозрительных по заболеванию лошадей путем постановки реакции диффузионной преципитации (РДП).
3.2. Исследование проводят в соответствии с «Методикой постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей» рекомендованной Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 5 мая 1977 г.
3.3. Следует иметь в виду, что при остром течении болезни и коротком инкубационном периоде даже при наличии клинических симптомов, характерных для инфекционной анемии, у исследуемого животного могут быть получены отрицательные результаты серологического исследования (антитела в диагностическом титре накапливаются через 2-6 нед. после заражения). В связи с этим в таких случаях исследуют кровь повторно через 1—15 дней.
Необходимо также учитывать, что в случаях длительных ремиссий у хронически больных лошадей или латентного течения болезни положительная РДП может быть и при отсутствии клинических признаков и гематологических показателей.
4. Гематологические исследования.
4.1. Гематологические исследования включают определение количества эритроцитов в 1 мм3 крови, количества гемоглобина и скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
4.2. Количество эритроцитов подсчитывают в камере Горяева. В пробирку с 4 мл 3%-ного раствора хлористого натрия вносят 0,02 мл крови. Форменные элементы считают в 80 маленьких или 5 больших квадратах, полученный результат умножают на 10000..
Подсчет эритроцитов можно провести и в электронном счетчике.
4.3. Гемоглобин определяют по общепринятому методу гемометром Сали и полученный результат выражают в г%.
4.4. Для определения СОЭ в эритросидиометр до отметки «0» наливают стабилизированную кровь и каждые 15 мин. учитывают в течение часа, а затем через 24 ч отмечают уровень оседания эритроцитов. Для больных лошадей характерна повышенная СОЭ, особенно в первые 15 мин. (60-70 делений). СОЭ определяют при комнатной температуре.
4.5. Сравнительные показатели крови здоровых и больных лошадей следующие:
Вид исследований / Показатели крови здоровых лошадей при нормальной упитанности / Показатели крови лошадей, больных инфекционной анемией
Эритроциты, млн./мм3 От 5 до 9              4,5 и ниже
Гемоглобин, г%                  7,6            5,0 и ниже
СОЭ (делений за 1 ч) 45-60            66 и более
4.6. Следует иметь в виду, что в начале заболевания при первом подъеме температуры резкие отклонения от нормы количества эритроцитов и процента гемоглобина, как правило, отсутствуют. У хронически больных инфекционной анемией животных эти показатели восстанавливаются до нормы, а СОЭ остается повышенной.
4.7. У лошадей с повышенной температурой тела следует исключить наличие нутталий, пироплазм.
5. Методика гистологического исследования.
5.1. Для гистологического исследования готовят срезы и окрашивают их гематоксилин-эозином общепринятым методом.
Срезы для исследования на гемосидерин окрашивают по Перлсу. Для этого срезы из чашки с дистиллированной водой переносят в смесь 2%-ного водного раствора желтой кровяной соли и 1%-ного водного раствора соляной кислоты (в пропорции на 2 капли первого раствора 1 мл второго). В этой смеси срезы выдерживают до появления синей окраски (15-20 мин.), после чего промывают их в течение 10 мин дистиллированной  водой, затем докрашивают 10 мин. 1%-ным раствором квасцового кармина. Далее проводят через спирты, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Зернышки гемосидерина окрашиваются в голубой или зеленоватый цвет. При окрашивании срезов следует пользоваться только дистиллированной водой и стеклянными иглами (исключают железосодержащие предметы).
6. Постановка биологической пробы.
6.1. Для биологической пробы отбирают двух жеребят в возрасте 6-12 мес. (допускается использование более взрослых животных) из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням.
Перед постановкой биопробы жеребят подвергают четырехкратным клинико-гематологическим и серологическим исследованиям с интервалом в 7 дней.
6.2. Для заражения жеребят берут стерильно от наиболее подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей кровь в количестве по 300-500 мл от каждой, лучше во время подъема температуры.
6.3. Жеребят заражают сывороткой крови или плазмой. При необходимости их фильтруют через фильтр Зейтца, затем фильтрат проверяют на стерильность и безвредность путем высева на питательные среды (МПБ, МПА, МППБ) и инъекции трем белым мышам подкожно в дозе 1 мл.
Если через 3 дня рост микрофлоры на питательных средах отсутствует и белые мыши остаются живыми, сыворотку крови вводят двум жеребятам подкожно или внутривенно в дозе 100-200 мл каждому. Дефибринированную кровь вводят только подкожно в той же дозе.
6.4. Групповую биопробу проводят путем заражения двух жеребят смесью сыворотки (плазмы) крови 10-15 лошадей-продуцентов. Смесь вводят подкожно в количестве 100-200 мл каждому жеребенку.
6.5. Наблюдения за зараженными животными ведут в течение 90 дней, при этом каждые 10-15 дней проводят гематологические и серологические исследования.
6.6. Биологическую пробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических симптомов заболевания – рецидивирующей лихорадки, слабости, бледности или желтушности слизистых оболочек, исхудания и при получении положительных результатов серологических, гематологических исследований.
6.7. Жеребят, давших сомнительные результаты клинико-гематологических и серологических исследований, подвергают убою и исследуют патологоанатомически и гистологически. При положительном результате обнаруживают следующие патологоанатомические изменения: серозно-геморрагическую инфильтрацию подкожной и межмышечной клетчатки, гиперемию и отек лимфоузлов, зернистую или жировую дистрофию скелетной мускулатуры, миокарда, почек, множественные кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках и под капсулой органов. Селезенка сильно гиперемирована, увеличена, с выраженной дольчатостью на разрезе, паренхима имеет мускатный рисунок.
Гистологические изменения соответствуют описанным в приложении.
6.8. Биопробу считают отрицательной при отсутствии у подопытных жеребят симптомов болезни и получении отрицательных результатов серологических и гематологических исследований.
7. Сроки исследований: серологического – 7 дней, гематологического – 2, гистологического – 14, биологического- 90 дней.
Приложение Патогистологические изменения при инфекционной анемии.
Характер и степень патогистологических изменений зависит от стадии болезни, количества рецидивов, ремиссий и их продолжительности.
При острой форме болезни обнаруживают: в печени – пролифераты эндотелия синусов и купферовских клеток со скоплением в синусах крупных гистиоцитов, содержащих гемосидерин, гистиоцитарно-лимфоидные пролифераты в междольковой соединительной ткани.
Печеночные клетки в состоянии жировой или зернистой дистрофии; в селезенке – пульпа инфарцирована эритроцитами и обеднена лимфоцитами, количество гемосидерина резко снижено или, наоборот, кровенаполнение слабое, а фолликулы гиперплазированы, количество гемосидерина в норме или несколько повышено; в почках и сердце – гиперемия, кровоизлияния, серозный отек интерстиция, слабые пролифераты гистиоцитарных и лимфоидных клеток, жировая или зернистая дистрофия, иногда небольшие отложения гемосидерина в эндотелиальных клетках и гистиоцитах; лимфатические узлы гиперемированы, с кровоизлияниями; в легких – кровоизлияния под плевру.
Хроническая форма болезни характеризуется следующими изменениями: в печени – диффузные пролифераты лимфоидных клеток и в меньшей степени мелких гистиоцитов, содержащих гемосидерин. У животных, павших в период тяжелого обострения, в печени находят скопления крупных гистиоцитов, нагруженных гемосидерином; в селезенке – диффузная гиперплазия и резкое уменьшение количества гемосидерина или его полное исчезновение. Кроме того, у лошадей, павших во время приступа, в селезенке отмечают повышенное кровенаполнение синусов и очаговое инфарцирование пульпы эритроцитами; в почках –  продуктивный гломерулонефрит, сосудистые клубочки увеличены и обогащены ядрами. Между канальцами и вокруг сосудов – скопления лимфоидных клеток. У животных, павших во время тяжелого лихорадочного приступа, в полости капсулы сосудистых клубочков находят серозный, а иногда серозно-геморрагический экссудат, гемосидерин находят в клубочках и гистиоцитах; в сердце – очаговый или диффузный интерстициальный миокардит с преимущественным поражением предсердий (особенно левого); в лимфатических узлах – лимфоцитоз и незначительное отложение гемосидерина; в легких – пролифераты лимфоидных клеток, а также гистиоцитов, нагруженных гемосидерином.
В поздних стадиях болезни в почках отмечают цирроз и склероз сосудистых клубочков. В сердце – миофиброз и склероз миокарда и эндокарда.
В период ремиссий изменения претерпевают обратное развитие или могут отсутствовать, за исключением стойких необратимых процессов: лимфоцитоз паренхимы селезенки, хронический гломерулонефрит, склероз эндо- и миокарда.

Временные методические указания по лабораторной диагностике инфекционной анемии лошадей.(Утверждены 25 марта 1983 г.)
Временные методические указания по лабораторной диагностике инфекционной анемии лошадей.(Утверждены 25 марта 1983 г.)1. Общие положения.1.1. Инфекционная анемия лошадей – вирусная болезнь однокопытных животных, характеризующаяся рецидивирующей лихорадкой, анемией, а также бессимптомным вирусоносительством.1.2. Лабораторный диагноз на инфекционную анемию устанавливают на основании результатов серологических (РДП), гематологических и патоморфологических исследований. В сомнительных случаях для проверки особо ценных лошадей ставят биологическую пробу. При исследовании сывороток лошадей — продуцентов ставят групповую биопробу.2. Взятие материала.2.1. Для исследования в ветеринарную лабораторию доставляют: сыворотку крови лошадей (5-6 мл) для серологического исследования; кровь (10-12 мл), стабилизированную 20%-ным раствором лимоннокислого натрия, для гематологического исследования (кровь берут до поения и кормления животного); кусочки печени, селезенки, почек, сердца, легких и лимфатических узлов, взятых от павших или убитых с диагностической целью животных для гистологического исследования.2.2. Сыворотку крови или дефибринированную кровь от подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей для постановки биопробы берут, как указано в п.6.3. Серологическое исследование.3.1. Серологический метод диагностики инфекционной анемии основан на обнаружении антител к вирусу этой болезни в сыворотке крови подозрительных по заболеванию лошадей путем постановки реакции диффузионной преципитации (РДП).3.2. Исследование проводят в соответствии с «Методикой постановки реакции диффузионной преципитации (РДП) для серологической диагностики инфекционной анемии лошадей» рекомендованной Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 5 мая 1977 г.3.3. Следует иметь в виду, что при остром течении болезни и коротком инкубационном периоде даже при наличии клинических симптомов, характерных для инфекционной анемии, у исследуемого животного могут быть получены отрицательные результаты серологического исследования (антитела в диагностическом титре накапливаются через 2-6 нед. после заражения). В связи с этим в таких случаях исследуют кровь повторно через 1—15 дней.Необходимо также учитывать, что в случаях длительных ремиссий у хронически больных лошадей или латентного течения болезни положительная РДП может быть и при отсутствии клинических признаков и гематологических показателей.4. Гематологические исследования.4.1. Гематологические исследования включают определение количества эритроцитов в 1 мм3 крови, количества гемоглобина и скорости оседания эритроцитов (СОЭ).4.2. Количество эритроцитов подсчитывают в камере Горяева. В пробирку с 4 мл 3%-ного раствора хлористого натрия вносят 0,02 мл крови. Форменные элементы считают в 80 маленьких или 5 больших квадратах, полученный результат умножают на 10000…Подсчет эритроцитов можно провести и в электронном счетчике.4.3. Гемоглобин определяют по общепринятому методу гемометром Сали и полученный результат выражают в г%.4.4. Для определения СОЭ в эритросидиометр до отметки «0» наливают стабилизированную кровь и каждые 15 мин. учитывают в течение часа, а затем через 24 ч отмечают уровень оседания эритроцитов. Для больных лошадей характерна повышенная СОЭ, особенно в первые 15 мин. (60-70 делений). СОЭ определяют при комнатной температуре.4.5. Сравнительные показатели крови здоровых и больных лошадей следующие:Вид исследований / Показатели крови здоровых лошадей при нормальной упитанности / Показатели крови лошадей, больных инфекционной анемиейЭритроциты, млн./мм3 От 5 до 9 4,5 и нижеГемоглобин, г% 7,6 5,0 и нижеСОЭ (делений за 1 ч) 45-60 66 и более4.6. Следует иметь в виду, что в начале заболевания при первом подъеме температуры резкие отклонения от нормы количества эритроцитов и процента гемоглобина, как правило, отсутствуют. У хронически больных инфекционной анемией животных эти показатели восстанавливаются до нормы, а СОЭ остается повышенной. 4.7. У лошадей с повышенной температурой тела следует исключить наличие нутталий, пироплазм.5. Методика гистологического исследования.5.1. Для гистологического исследования готовят срезы и окрашивают их гематоксилин-эозином общепринятым методом. Срезы для исследования на гемосидерин окрашивают по Перлсу. Для этого срезы из чашки с дистиллированной водой переносят в смесь 2%-ного водного раствора желтой кровяной соли и 1%-ного водного раствора соляной кислоты (в пропорции на 2 капли первого раствора 1 мл второго). В этой смеси срезы выдерживают до появления синей окраски (15-20 мин.), после чего промывают их в течение 10 мин дистиллированной водой, затем докрашивают 10 мин. 1%-ным раствором квасцового кармина. Далее проводят через спирты, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Зернышки гемосидерина окрашиваются в голубой или зеленоватый цвет. При окрашивании срезов следует пользоваться только дистиллированной водой и стеклянными иглами (исключают железосодержащие предметы).6. Постановка биологической пробы.6.1. Для биологической пробы отбирают двух жеребят в возрасте 6-12 мес. (допускается использование более взрослых животных) из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням.Перед постановкой биопробы жеребят подвергают четырехкратным клинико-гематологическим и серологическим исследованиям с интервалом в 7 дней.6.2. Для заражения жеребят берут стерильно от наиболее подозрительных по заболеванию инфекционной анемией лошадей кровь в количестве по 300-500 мл от каждой, лучше во время подъема температуры.6.3. Жеребят заражают сывороткой крови или плазмой. При необходимости их фильтруют через фильтр Зейтца, затем фильтрат проверяют на стерильность и безвредность путем высева на питательные среды (МПБ, МПА, МППБ) и инъекции трем белым мышам подкожно в дозе 1 мл.Если через 3 дня рост микрофлоры на питательных средах отсутствует и белые мыши остаются живыми, сыворотку крови вводят двум жеребятам подкожно или внутривенно в дозе 100-200 мл каждому. Дефибринированную кровь вводят только подкожно в той же дозе.6.4. Групповую биопробу проводят путем заражения двух жеребят смесью сыворотки (плазмы) крови 10-15 лошадей-продуцентов. Смесь вводят подкожно в количестве 100-200 мл каждому жеребенку.6.5. Наблюдения за зараженными животными ведут в течение 90 дней, при этом каждые 10-15 дней проводят гематологические и серологические исследования.6.6. Биологическую пробу считают положительной при наличии у зараженных жеребят характерных клинических симптомов заболевания – рецидивирующей лихорадки, слабости, бледности или желтушности слизистых оболочек, исхудания и при получении положительных результатов серологических, гематологических исследований.6.7. Жеребят, давших сомнительные результаты клинико-гематологических и серологических исследований, подвергают убою и исследуют патологоанатомически и гистологически. При положительном результате обнаруживают следующие патологоанатомические изменения: серозно-геморрагическую инфильтрацию подкожной и межмышечной клетчатки, гиперемию и отек лимфоузлов, зернистую или жировую дистрофию скелетной мускулатуры, миокарда, почек, множественные кровоизлияния на слизистых, серозных оболочках и под капсулой органов. Селезенка сильно гиперемирована, увеличена, с выраженной дольчатостью на разрезе, паренхима имеет мускатный рисунок.Гистологические изменения соответствуют описанным в приложении.6.8. Биопробу считают отрицательной при отсутствии у подопытных жеребят симптомов болезни и получении отрицательных результатов серологических и гематологических исследований.7. Сроки исследований: серологического – 7 дней, гематологического – 2, гистологического – 14, биологического- 90 дней.Приложение Патогистологические изменения при инфекционной анемии.Характер и степень патогистологических изменений зависит от стадии болезни, количества рецидивов, ремиссий и их продолжительности.При острой форме болезни обнаруживают: в печени – пролифераты эндотелия синусов и купферовских клеток со скоплением в синусах крупных гистиоцитов, содержащих гемосидерин, гистиоцитарно-лимфоидные пролифераты в междольковой соединительной ткани.Печеночные клетки в состоянии жировой или зернистой дистрофии; в селезенке – пульпа инфарцирована эритроцитами и обеднена лимфоцитами, количество гемосидерина резко снижено или, наоборот, кровенаполнение слабое, а фолликулы гиперплазированы, количество гемосидерина в норме или несколько повышено; в почках и сердце – гиперемия, кровоизлияния, серозный отек интерстиция, слабые пролифераты гистиоцитарных и лимфоидных клеток, жировая или зернистая дистрофия, иногда небольшие отложения гемосидерина в эндотелиальных клетках и гистиоцитах; лимфатические узлы гиперемированы, с кровоизлияниями; в легких – кровоизлияния под плевру.Хроническая форма болезни характеризуется следующими изменениями: в печени – диффузные пролифераты лимфоидных клеток и в меньшей степени мелких гистиоцитов, содержащих гемосидерин. У животных, павших в период тяжелого обострения, в печени находят скопления крупных гистиоцитов, нагруженных гемосидерином; в селезенке – диффузная гиперплазия и резкое уменьшение количества гемосидерина или его полное исчезновение. Кроме того, у лошадей, павших во время приступа, в селезенке отмечают повышенное кровенаполнение синусов и очаговое инфарцирование пульпы эритроцитами; в почках — продуктивный гломерулонефрит, сосудистые клубочки увеличены и обогащены ядрами. Между канальцами и вокруг сосудов – скопления лимфоидных клеток. У животных, павших во время тяжелого лихорадочного приступа, в полости капсулы сосудистых клубочков находят серозный, а иногда серозно-геморрагический экссудат, гемосидерин находят в клубочках и гистиоцитах; в сердце – очаговый или диффузный интерстициальный миокардит с преимущественным поражением предсердий (особенно левого); в лимфатических узлах – лимфоцитоз и незначительное отложение гемосидерина; в легких – пролифераты лимфоидных клеток, а также гистиоцитов, нагруженных гемосидерином.В поздних стадиях болезни в почках отмечают цирроз и склероз сосудистых клубочков. В сердце – миофиброз и склероз миокарда и эндокарда.В период ремиссий изменения претерпевают обратное развитие или могут отсутствовать, за исключением стойких необратимых процессов: лимфоцитоз паренхимы селезенки, хронический гломерулонефрит, склероз эндо- и миокарда.