Железосодержащие пигменты из гемоглобина

ГИСТОХИМИЯ ПИГМЕНТОВ

Термин «пигменты» охватывает группу веществ, поглощающих свет в видимом спектре и наблюдаемых в неокрашенных клетках и тканях. Под это определение подходят вещества различ­ного происхождения, состава и функционального назначения. По происхождению пигменты можно разделить на экзогенные (в частности, угольная или известковая пыль, отложения метал­лов, химиотерапевтических веществ и др.) и эндогенные. Эндогенные пигменты разделяют на гематогенные (например, гемоглобин и его производные) и негематогенные, или аутогенные (например, меланин и жировые пигменты — липофусцины и каротиноиды).

В гистохимическом отношении пигменты мало различаются. Несмотря на то, что химический состав ряда пигментов выяснен не до конца, гистохимически их можно выявить с достаточно высокой степенью надежности, тем более что большинство из них имеет характерную тканевую локализацию.

Выявление гемосидерина и гемоглобина

Гемосидерин — железосодержащий пигмент, образующийся из гемоглобина в результате внутриклеточных превращений. 

Для выявления гемоглобина пригодна реакция псевдопероксидазы с бензидином, а идентификация гемосидерина основана на определении содержащегося в нем железа с помощью реакции Перлса с кислым ферроцианидом. 

Кроме того, гемосидерин дает положительную ШИК-реакцию, обусловленную его нахождением в белково-полисахаридном комплексе. Резко положительна реакция этого комплекса с тетразолием после бензотирования.

Выявление гемоглобина бензидином по Пикворту

1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до воды.

3. Промывают в метаноле.

4. Перевернутое стекло со срезом помещают в раствор бензидина (0,2 г бензидина и маленький кристаллик нитропруссида натрия растворяют в 15 мл метанола, добавляют 4 капли ледяной уксусной кислоты и встряхивают) в чашке для окрашивания на 5-10 мин.

5. Смывают бензидин озонированным эфиром (50 мл 3 % перекиси водорода, 100 мл метанола и 50 мл эфира).

6. Помещают срез на 10 мин в свежую порцию озонированного эфира.

7. Промывают в проточной воде 10-15 мин.

8. Докрашивают ядра в 1% водном растворе нейтрального красного 3 мин.

9. Промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в  дистрен-дибутил-ксилол.

Результат: 

гемоглобин и некоторые «оксидазные» гранулы лейкоцитов окрашиваются в темно-синий цвет, ядра — в красный.

 ———————————————————————————————–

Трехцветный метод выявления билирубина, гемосидерина и липофусцина 

по Гпеннеру

1. Срезы толщиной 10 мкм готовят в криостате, наклеивают на стекла и подсушивают при комнатной температуре.

2. Погружают на 5 мин в 2 % раствор гексацианоферрата калия.

3. Обрабатывают 20 мин свежеприготовленной смесью равных  частей 2 % гексацианоферрата калия и 5 % уксусной кислоты.

4. Ополаскивают в проточной воде и обрабатывают в течение 15 мин 3 % раствором бихромата калия с рН 2,2.

5. Промывают в воде.

6. Окрашивают свежепрофильтрованным раствором жирового красного-О в изопропаноле 20мин.

7. Промывают в проточной воде в течение 5 мин.

8. Заключают в сироп Апати.

Результат: 

липофусцины окрашиваются в оранжево-красный цвет, 

гемосидерин — в синий, 

билирубин — в темный изумрудно-зеленый.

Примечание. 

Гемосидерин растворяется в кислотах, поэтому для его выявления не следует применять кислые фиксаторы .

Выявление желчных пигментов

Желчные пигменты, как и гемосидерин, являются продуктом разложения гемоглобина и других железосодержащих белков. Основные желчные пигменты — билирубин и биливердин — обладают кислотными свойствами и образуют со щелочнозе­мельными металлами соли, не растворимые в воде. Их идентификация возможна с помощью окраски метиленовым синим, реакций Гмелина и Штейна. Реакция Гмелина основана на окислении билирубина азотной кислотой, а реакция Штейна — на окислении его йодом. Метод Штейна позволяет выявить все желчные пигменты.

Реакция с йодом на желчные пигменты по Штейну

1. Материал фиксируют в формалине или спирте, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до воды.

3. Обрабатывают 12 — 18 ч йодным реактивом 

(2 части раствора Люголя и 1 часть 10 % раствора йода на 96 % спирте).

4. Промывают в проточной воде 5 мин.

5. Обесцвечивают 5 % раствором тиосульфата натрия 30 с.

6. Промывают и докрашивают квасцовым кармином Майера 3-18 ч.

7. Промывают в воде, обезвоживают абсолютным ацетоном, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.

Результат: 

желчные пигменты окрашиваются в темно-зеле­ный цвет, 

ядра—в красный.

Выявление меланина

Меланин имеет сложную полимерную структуру и обычно окрашен в черно-коричневый цвет, хотя имеются и другие оттенки — до желтого и даже фиолетового. Как правило, он встречается в форме гранул — меланосом — в клетках тканей эктодермального происхождения — в эпидермисе, волосах, волосяных фолликулах, меланомах кожи, пигментном эпителии радужки, сетчатке. В нервной системе присутствует разновидность меланина — нейромеланин. 

Меланин синтезируется в промеланосомах через окисление тирозина до ДОФА при участии тирозиназы и пероксидазы. На этом основаны методы специфического контрастирования и электронно-микроскопического гистохими­ческого выявления промеланосом по положительной реакции на тирозиназу.

Выявление меланина основано на его способности образовывать комплексы с ионами двухвалентного железа, которые легко обнаруживаются гексацианоферратом калия в реакции турнбулевой сини. На этом принципе основан метод Лилли.

«Железный» метод выявления меланина 

по Лилли

1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до воды.

3. Помещают в 2,5 % раствор сульфата железа гептагидрата на 60 мин.

4. Промывают в 4 сменах дистиллированной воды по 5 мин.

5. Помещают в 1 % раствор гексацианоферрита (III) калия в 1 % уксусной кислоте на 30 мин.

6. Промывают в 1 % уксусной кислоте.

7. При желании докрашивают пикрофуксином по Ван-Гизону.

8. Проводят через спирт возрастающей концентрации и кси­лол, заключают в бальзам.

Результат: 

меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне; такой же цвет имеет гемосидерин.

Меланин, как и липофусцин, обладает способностью восстанавливать раствор аммиачного серебра. На этом основан принцип электронно-микроскопического гистохимического выявления промеланосом и меланосом по Мисиме. Раздельное выявление меланина и липофусцина возможно по их разному окрашиванию нильским синим. Кроме того, липофусцин в отличие от меланина дает видимую собственную флюоресценцию в ультра­фиолетовом свете.

Импрегнация серебром промеланосом и меланосом 

по Мисиме

1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 10 % формальдегиде на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при 4 “С.

2. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

3. Инкубируют в растворе аммиачного серебра 40 — 60 мин при 58 °С.

4. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.

5. Кусочки ткани помещают на 1 —2 мин в раствор трихлорида золота (5 мл 6 % тиосульфата натрия смешивают с 5 мл 6 % тиоцианата аммония и добавляют по каплям 2 % раствор трихлорида золота до образования розовато-красного осадка).

6. Кусочки ткани помещают сразу в 0,6 % раствор тиосуль­фата натрия на 8 мин.

7. Тщательно промывают в дистиллированной воде.

8. Дополнительно фиксируют в 0,6 % забуференном растворе перманганата калия или в 1 % забуференном растворе тетра­оксида осмия (рН 7,4) 1 ч при 4 “С.

9. Обезвоживают и заливают.

Результат: 

серебрятся меланосомы и премеланосомы. 

Гранулярные отложения металлического серебра выявляются и в тех премеланосомах, в которых меланин не образуется (у альбиносов).

Выявление липофусцина и меланина с применением нильского синего 

по Лилли

1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин.

2. Депарафинированные среды доводят до воды.

3. Окрашивают в течение 20 мин 0,05 % раствором нильского синего А в 1 % серной кислоте.

4. Промывают в проточной воде 10 — 20 мин.

5. Можно также быстро ополоснуть в 1 % растворе серной кислоты и обезводить в 4 порциях абсолютного ацетона.

6. Заключают после п. 3 в глицерин-желатин или после п. 4 проводят через ксилол и заключают в синтетическую среду.

Результат: 

если обработка включала пп. 4 и 6, то липофус­цины окрашиваются в темно-синий или зеленый цвет, меланин -в темно-зеленый; при обработке с включением пп. 5 и б меланин окрашивается в темно-зеленый цвет, а липофусцины сохраняют свою первоначальную окраску.

Метод дифференцировки меланина от липофусцина 

по Хуэку

1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы помещают в дистиллированную воду.

3. Срезы окрашивают свежеприготовленным насыщенным водным раствором нильского синего 30мин.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Обесцвечивают 10 % перекисью водорода 24 ч.

6. Промывают в проточной воде.

7. Заключают в глицерин-желатин.

Результат:

липофусцин окрашивается в синий цвет, 

меланин в результате обработки перекисью водорода обесцвечивается.

Выявление жировых пигментов

Наряду с липофусцином к жировым пигментам относятся гемофусцин, цероид, псевдомеланин, железосодержащие липопигменты и каротиноиды.

Липофусцин обладает выраженной базофилией и сильной восстанавливающей способностью, на чем основана реакция Шморля – основная реакция на липофусцин. Липофусцин окрашивается также нильским синим.

Выявление кислотоустойчивых липофусцинов 

по Цилю—Нильсену

1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин.

2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды.

3. Окрашивают срезы в течение 3 ч при 60 °С в растворе карбол-фуксина (10 г основного фуксина + 50 г фенола + 100 мл спирта + 1000 мл дистиллированной воды).

4. Промывают в проточной воде.

5. Дифференцируют в 1 % солянокислом спирте до тех пор, пока эритроциты не станут розовыми.

6. Промывают в дистиллированной воде.

7. Докрашивают в железных квасцах или 0,5 % растворе 

то­луидинового синего.

8. Промывают в проточной воде.

9. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

кислотоустойчивые липофусцины окрашиваются в ярко-красный цвет, а липопротеиды приобретают красно­ватый оттенок; ядра окрашиваются в темно-синий или синий цвет.

Примечание. 

Из-за базофилии липофусцинов слишком сильная докраска обусловливает развитие темно-красного окрашивания. 

В присутствии фенола растворимость красителей в липидах повышается.

Метод Шморля для выявления липофусцина

1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин или получают срезы на замораживающем микротоме.

2. Срезы промывают в дистиллированной воде.

3. Помещают срезы на 5 — 20 мин в реакционную смесь 

[3 части 1 % раствора дихлорида железа смешивают с 1 частью 1 % раствора гексацианоферрата (III) калия; смесь используют в течение 30 мин после приготовления].

4. Срезы хорошо промывают в проточной воде. 

В особенно важных случаях рекомендуется проводить микроскопию срезов, заключенных в воду.

5. Быстро обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам.

Результат: 

липофусцин и меланин окрашиваются в темно-синий цвет. 

Кроме того, положительную реакцию дают аргентаффинные гранулы, а также ткани, содержащие активные SH-группы.

Примечание.

После п. 4 можно провести окрашивание ядер 1 % нейтральным красным в течение 3 мин.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

  16.11.2019117.25 Кб0pravo_metodichka (1).doc

• #
• #

  20.11.201990.11 Кб0Proek_skoly.doc

• #
• #