Формы гемоглобина крови у животных

«Люди забыли эту истину, — сказал Лис. — Но ты не должен ее забывать. Мы всегда будем в ответе за тех, кого приручили». Эта фраза из произведения «Маленький принц», как нельзя лучше описывает отношения человека и животного. Братья наши меньшие всегда будут нуждаться в ежедневной заботе, и наш долг – ее обеспечить.
 

Одним из распространенных видов исследования состояния здоровья животного является анализ крови. Среди всех компонентов, входящих в ее состав, важнейшую функцию выполняет гемоглобин, а процентное содержание этого вещества – показатель благополучия или наличия патологии в организме. Своевременное обнаружение отклонений от нормы позволит назначить эффективное лечение.
 

Гемоглобин – это сложный железосодержащий белок, который обеспечивает перенос кислорода из органов дыхания в ткани. Он также обладает свойством частично связывать углекислый газ и выводить его из организма. У человека и позвоночных животных содержится в эритроцитах, а у беспозвоночных – в плазме крови и других тканях. Благодаря этому белку повышается тонус, активизируется обмен веществ организма и укрепляется иммунитет.
 

На уровень гемоглобина влияет множество факторов: пол, возраст, порода, кормление, условия содержания, физические нагрузки, инфекционные болезни и даже высота над уровнем моря.
 

Содержание этого белка в крови животных в лабораторных условиях контролируется с помощью применения тест-наборов. В основном это фотометрические методы, позволяющие точно определить его концентрацию. У здоровых животных она составляет (г/л): крупный рогатый скот – 99-129; лошади – 80-140; овцы – 90-133; козы – 100-150; свиньи – 90-110; кошки – 100-140; собаки – 110-170; кролики – 105-125; куры – 80-120; утки – 100-125. Отклонение от нормы в меньшую или большую сторону является патологией и свидетельствует о нарушениях в организме животного. Так, например:
 

– увеличение количества гемоглобина в крови – гиперхромемия –наблюдается при обезвоживании по причине рвоты, диареи, потливости, при образовании жидкостей (транссудат – отёчная жидкость, скапливающаяся в полостях тела; экссудат – жидкость, выделяющаяся в ткани или полости организма из мелких кровеносных сосудов при воспалении);
 

– снижение гемоглобина в крови – олигохромемия – возникает при анемиях, вследствие кровотечений, в том числе внутренних, ряда инфекционных болезней, истощения, гемолиза эритроцитов, дефицита железа, витаминов В12 и фолиевой кислоты.
 

Заподозрить изменение уровня гемоглобина в крови животного позволяет наблюдение за питомцем. Так, к симптомам, позволяющим предположить увеличение концентрации гемоглобина, относятся: потеря аппетита; повышенная утомляемость; вялость и апатия; бледность или покраснение кожных покровов; расстройства в работе ЖКТ. Кровь животного становится темной и густой. Незначительный рост уровня гемоглобина может быть вызван физиологическими причинами, если при повторном анализе наблюдается норма – причин для беспокойства нет.
 

В случае понижения уровня гемоглобина может наблюдаться: синюшность или бледность слизистых оболочек; слабость и сонливость; учащение пульса и частоты дыхания; озноб и понижение базовой температуры тела (как следствие замедления обменных процессов). В связи с тем, что разрушение эритроцитов происходит по причине нехватки в организме железа, у животных может отмечаться металлический запах из пасти.
 

Низкий уровень гемоглобина встречается чаще и вызывает большую озабоченность, так как пониженные показатели указывают на наличие серьезных нарушений в функционировании организма животного. Недостаток гемоглобина при беременности, способен привести к серьёзным неблагоприятным последствиям – плод может недополучить кислород, необходимый для нормального развития головного мозга; возникает риск преждевременных родов.
 

При проявлении у животного симптомов изменения уровня гемоглобина, необходимо незамедлительно обращаться в ветеринарную клинику для прохождения обследования.

В биохимическом отделе ФГБУ «Челябинская МВЛ», подведомственного Россельхознадзору, проводятся исследования по определению содержания гемоглобина в крови домашних и сельскохозяйственных животных.
 

При диагностике важное значение имеет то, насколько правильно материал был доставлен в лабораторию. Специалисты ветеринарных клиник рекомендуют производить забор крови с утра до приема воды и пищи, по возможности в одни и те же часы. При этом животное должно находиться в спокойном состоянии. При взятии крови в пробирку, для предупреждения свертывания крови, используются антикоагулянты (противосвертывающие вещества) на 10 мл крови:
 

– щавелевокислый натрий (калий или аммоний) – 0,01-0,02 г (оксалатная кровь);

– лимоннокислый натрий – 0,02 г (цитратная кровь);

– фтористый натрий – 0,01 г;

– гепарин – 1 капля раствора, содержащего в 1 мл 5000 ME гепарина (гепаринизированная кровь).
 

Антикоагулянты вносят в пробирку, затем в нее собирают кровь; пробирку плотно закрывают резиновой пробкой и несколько раз переворачивают в течение 1-2 минут для наилучшего смешивания содержимого.
 

Любите своих животных, и они ответят вам взаимностью!

Е.Е. Федорова, специалист по связям с общественностью,

Л.А. Морозова, и.о. директора

Любой организм в соответствии с генотипом даже при наличии экстремальных условий обладает способностью сохранять постоянство гомеостаза. Очевидно, поэтому гематологические, биохимические и другие показатели различных систем отличаются стабильностью, подвергаясь под воздействием внешней среда лишь модификационной изменчивости, проявляющейся в незначительных отклонениях от нормы. На гематологические, биохимические и другие показатели существенное влияние оказывает не только физиологическое состояние животного (возраст, беременность, продуктивность), но и условия кормления, содержания, эксплуатации, а также среда обитания. Вместе с тем картина крови сохраняет свои индивидуальные и видовые особенности.
Наиболее научно обоснованным и присущим современному этапу развития биологической пауки, в том числе медицины и ветеринарии, является математический метод установления нормативов, основанный па теории вероятности с использованием исходных материалов, охватывающих результаты исследований больших групп разного возраста, пола, продуктивности здоровых животных, находящихся в различных климатических зонах.
При изучении особенностей вариационного распределения гематологических показателей было установлено, что для большинства из ниx характерно распределение, близкое к нормативному. Лишь в распределении эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов, ретикулоцитов и СОЭ имеется некоторая асимметрия. Для гематологических показателей, как уже принято в биологических исследованиях, нормативы должны иметь уровень достоверности не менее 0,05, т. е. норма — 95% здоровых животных и только в 5% случаев возможны отклонения, причины которых не известны. К сожалению, эти положения при установлении нормативов выполнены не всегда, так как были получены намного раньше, чем была разработана теория вероятности. Поэтому в предложенных многочисленными авторами нормативах морфологического состава кропи для ратных видов животных представлены только средине значения и их экстремальные отклонения (табл. 2, 3).

Определенные трудности вызывает вопрос о необходимости создания отдельных нормативов в зависимости от географических зон, различающихся природно-экономическими условиями. По-видимому, только в местностях, резко отличающихся, например, по высоте над уровнем моря, средней годовой температуре, разводимому типу скота, целесообразно иметь свои нормативы, что очень важно для изучения краевой патологии. Вместе с тем независимо от условий для объективной оценки результатов исследований необходимо знать особенности нормальной картины крови определенного вида животного.
Лошадь. Данный вид животного имеет гранулоцитарный профиль крови, когда нейтрофилы преобладают над остальными клетками. Специфическая зернистость в эозинофилах является наиболее крупной из аналогичных клеток всех животных. Эритроциты образуют цепочки, как и у человека, так называемые монетные столбики. СОЭ выражена и довольно высокая. Следует отметить, что лошади резко отличаются по показателям красной крови в зависимости от типа. Рысистые лошади (горячие) имеют более высокое содержание в крови эритроцитов и уровень гемоглобина, чем рабочие (холодные). В норме у них в крови присутствуют в незначительных количествах ретикулоциты, число которых увеличивается при различных анемиях.
Крупный рогатый скот. До 1 мес после рождения телята имеют нейтрофильный профиль крови при повышенном содержании палочкоядерных форм нейтрофилов, а в последующее время у крупного рогатого скота преобладают лимфоциты над гранулоцитами. СОЭ не выражена, поэтому обычно методически не исследуется. Среди эритроцитов отмечается анизоцитоз. Ретикулоциты и полихроматофилы в норме и даже при патологии в крови не появляются.
Овца. Данный вид животных имеет наиболее выраженный лимфоцитарный профиль крови с самого рождения. Зрелые нейтрофилы по сравнению с крупным рогатым скотом более сегментированы, число которых составляет обычно 3— 4 фрагмента. Количество эритроцитов по сравнению с крупным рогатым скотом несколько выше, но они намного меньше. Ретикулоциты отсутствуют. В норме анизоцитоз, пойкилоцитоз, СОЭ не выражена.
Коза. У данного вида наиболее высокие показатели красной крови, которые завысят от мест их обитания. Высокогорные козы имеют более высокое содержание в крови эритроцитов и уровень гемоглобина. Эритроциты очень мелкие, ретикулоциты отсутствуют. СОЭ также не выражена.
Свинья. Количество лейкоцитов в крови свиней несколько выше, чем у других видов сельскохозяйственных животных. Лимфоциты являются преобладающими клетками белой крови. Среди нейтрофилов число палочкоядерных форм клеток повышено. Ретикулоциты и полихроматофилы постоянно присутствуют как в норме, так при патологии.
Собака. Как и лошадь, собака имеет нейтрофильный профиль крови. В норме в небольших количествах даже у взрослых особей, встречаются полихроматофилы и ретикулоциты, а иногда эритроциты с тельцами Жоли и даже нормобласты. У данного вида выражены, как и у лошади, породные различия в составе красной крови. Гончие собаки имеют более высокое содержание эритроцитов и уровень гемоглобина.
Кошка. Количество лейкоцитов у данного вида животного колеблется в широких пределах (от 10 до 20 тыс. клеток в 1 мкл крови). Соотношение гранулоцитов и лимфоцитов почти равное. В отличие от других видов млекопитающих у кошек гранулы в эозинофилах расположены густо и часто имеют палочковидную форму неодинаковой величины.
Кролик. Нейтрофилы у кролика содержат очень крупную зернистость напоминающую по размерам и окраске зернистость эозино-филов, и поэтому эти клетки были названы псевдоэозинофилами. В картине красной крови, особенно в молодом возрасте, много полихроматофилов и реттисулоцитов.
Птицы. Количество лейкоцитов у всех видов птиц по сравнению с млекопитающими животными в несколько раз выше и колеблется в широких пределах (от 20 до 40 тыс. в 1 мкл крови). Профиль крови обычно лимфоцитарный. Зернистость в нейтрофилах, которая, как и у кролика, называется псевдоэозинофилами, в эозинофилах довольно сходная и представлена многочисленными эозинофильными гранулами различной величины и формы. Однако в эозинофилах гранулы обычно круглые и реже палочковидные, у псевдоэозинофилов, наоборот, гранулы, как правило, палочковидные с заострением на концах. Эритроциты у всех птиц содержат ядро и имеют эллипсовидную форму. Нередко встречаются полихромные эритроциты и клетки с витальной зернистостью. Тромбоциты также содержат ядро, т. е. являются настоящими клетками, а не пластинками, как у млекопитающих. Тромбоцита у птиц — самые мелкие клетки крови, приближающиеся по размеру к малым лимфоцитам.
Причины различий в морфологическом составе крови у различных видов животных не вполне ясны, но, вероятно, обусловлены особенностями обмена веществ. В практическом отношении важно значь, что животные с различным профилем крови (лимфоцитарный, нейтрофильный) несколько иначе реагируют на воздействие внутренних и внешних факторов. В частности, у лошадей, собак реакция па воспалительные процессы довольно сильная и выражается обычно в резком лейкоцитозе в результате значительного увеличения количества нейтрофилов со сдвигом «влево», вплоть до развития лейкемоидной реакции миелоидного типа (например, при хрониосепсисе). У крупного рогатого скота, наоборот, воспалительные процессы, даже хрониосепсис, не вызывают в крови значительных изменений, хотя реакция также однотипна, т. е. лейкоцитоз с нейтрофилезом и регенеративным сдвигом.
Следует также отметить, что у животных с лимфоцитарным профилем крови чаще наблюдаются лейкозы лимфоидной формы, а у животных с нейтрофильной картиной кропи преимущественно встречаются миелолейкозы. У кур, эритроциты которых имеют ядра, кроме того, встречаются эритробластозы, последние пока не описаны у других сельскохозяйственных животных.

• Функциональные методы выделения и идентификации Т- и В-лимфоцитов крови
• Определение фагоцитарной активности лейкоцитов
• Определение некоторых физико-химических показателей крови
• Методы лейкоконцентрации
• Подсчет лейкоцитарной формулы и других цитограмм
• Приготовление цитологических препаратов, методы их фиксации и окраски
• Пункция кроветворных органов (техника и инструментарий)
• Получение проб крови и отдельных их компонентов
• Клиническая иммуногематология
• Система свертывания крови и противосвертывающие механизмы

Определение содержания гемоглобина в крови животных является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора [3].

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и

быстрые в исполнении. Кровь животного – это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа [1].

Повышение: некоторые формы гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.

Понижение (анемия): различные виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну – гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму – гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

При определении гемоглобина двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа [7].

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе [6].