Гемиглобинцианидный метод измерения гемоглобина крови

Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:

• феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
• цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
• дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
• не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.

Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный метод проводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный метод с калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.

Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.

Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.

• Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
• Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
• Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
• Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.

Формула для определения количества гемоглобина:

Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10

• Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
• Eст – экстинкция стандартного образца;
• С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
• К – коэффициент разведения биологической жидкости;
• 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
• 10 – число для пересчета г% в г/л.

После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.

Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.

Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.

Плюсы гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Исследование с помощью добавления цианида к крови имеет множество положительных сторон:

• исследование унифицировано, то есть считается достоверным, одобрено Комитетом здравоохранения;
• методика позволяет перевести все формы гемоглобина в одну, которую возможно рассчитать с помощью фотоколориметра;
• полученный гемиглобинцианид имеет длину волны 540 м, которую улавливает полуавтоматический оптический прибор для определения показателя;
• использование дешевых реактивов, которые не приносят клиническому учреждению больших финансовых затрат;
• простата методики, которую может выполнить любой врач лаборант;
• большой срок годности реактивов;
• применение незначительного количества реактива для 1 исследования, что позволяет проводить множество анализов за 1 сутки;
• быстрота проведения анализа, которая переводит его в экспресс-метод;
• применение полуавтоматического анализатора, самостоятельно подсчитывающего данные, что снижает риск получения врачебной ошибки.

Минусы гемиглобинцианидного метода определения гемоглобина

Использование цианидных реактивов в лабораторной диагностике устарела. Это вызвано тем, что исследование имеет следующие отрицательные стороны:

• возможность поражения кожных покровов и дыхательных путей врача-лаборанта реактивами;
• наличие более современных методов, которые более безопасны для лаборанта;
• возможность врачебной ошибки в неправильной подборке дозировки реактивов;
• прибор не выдает данные по определению формы или размеров клеток, поэтому для их выявления требуется проведение дополнительных анализов.

Так как цианидные соединения являются вредными для человека, разработан гемихромнй метод. Он полностью безопасен и на данный момент вытесняет гемиглобинцианидную методику из клинической лабораторной диагностики.

Показания к применению гемиглобинцианидного метода

Для проведения методики необходимые показания я ее проведению.

• Плановая диспансеризация пациента, проверка состояния его здоровья. Определение гемоглобина является одним из наиболее частых методик в лабораторной диагностике, так как показатель влияет на состояние множества тканей и органов.
• Наличие заболевания красного костного мозга, которое приводит к снижению количества эритроцитов или сразу всех ростков кроветворения.
• Чрезмерная продукция эритроцитов в красном костном мозге, которая приводит к эритроцитемии. Повышение количества Hb до критических значений не является положительной стороной, состояние требует лечебных мероприятий.
• Подозрение на анемию.
• Определение показателей во время проведения лечебных мероприятий. После получения данных врач может скорректировать дозировку препаратов или заменить их.

Возможные ошибки в применении гемиглобинцианидного метода

Исследование крови с помощью методики может быть неточной. Это вызвано тем, что возможны различные ошибки в ее проведении:

• нарушения в подготовке пациента к исследованию (отсутствие диеты, использование активных физических нагрузок, употребление некоторых категорий лекарств);
• нарушение правил забора крови (резкое изменение положения тела пациента в пространстве, работа кулаком при взятии венозной крови, использование не стерильных инструментов и пробирок);
• отсутствие добавления антикоагулянта, что приводит к образованию сгустка и делает невозможным проведение исследования;
• чрезмерно долгое стояние пробы без проведения исследования;
• неправильная дозировка реактивов, вышедший срок годности химических веществ, неправильно подобранная концентрация жидкости для разведения, отсутствие перемешивания крови после добавления реактива, осуществление исследования без настаивания полученной жидкости после добавления химических веществ;
• ошибка в расчете формулы;
• использование загрязненных приборов или фотоколориметра, что делает проведение исследования невозможным, так как прибор не может рассчитать длину волны.

Для исключения получения неточных данных врач должен назначить несколько исследований. Если оба показателя примерно одинаковы, это говорит о достоверности. Перед назначением анализа врач должен предупредить о подготовительных мероприятиях, которым должен в точности руководствоваться пациент. Это связано с тем, что уровень показателя зависит от состояния организма и воздействующих на него факторов. 

Гемиглобинцианидный метод – точная методика, которая использовалась в лабораториях раннее. На данный момент она заменена другими исследованиями, так как применение цианидных компонентов может нанести вред здоровью врача-лаборанта. Несмотря на это, анализ считается наиболее точным и достоверным, поэтому он был унифицирован Комитетом здравоохранения. Методика проста в использовании, реактивы недорогие, анализы проводятся быстро. 

Современным и точным методом измерения гемоглобина сегодня является гемихромный метод. Возможно, Вам будет интересно почитать обзор всех методов определения гемоглобина в крови.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео

Руководитель Департамента государственного контроля

качества, эффективности, безопасности лекарственных

средств и медицинской техники МЗ РФ

Р.У. Хабриев

17.06.2000 г.

Рекомендована к утверждению

Комиссией по лабораторным реагентам

 Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 

(протокол № 1 от 31.01.2000 г.) 

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для определения

гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом

НАЗНАЧЕНИЕ 

Набор предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (метод Drabkin) в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. 

Набор рассчитан на проведение 600 определений при расходе 5,0 мл рабочего раствора на один анализ.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 (500–560) нм.

СОСТАВ НАБОРА

1. Трансформирующий реагент – сухая смесь (натрий углекислый кислый, 1,0 г; калий железосинеродистый, 200 мг) – 3 упаковки.

2. Ацетонциангидрин – 3 ампулы (по 0,5 мл).

3. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л – 1 флакон (2 мл).

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Линейная область определения концентрации гемоглобина – в диапазоне от 20 до 200 г/л, отклонение от линейности – не более 2%.

Чувствительность определения – не более 10 г/л.

Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 2%.

Нормальные величины концентрации гемоглобина в крови составляют:

     – у мужчин 130–160 г/л;

     – у женщин 120–140 г/л.

Качество набора можно оценивать с использованием контрольных растворов гемоглобина отечественного или зарубежного производства. 

Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При работе с данным набором необходимо соблюдать правила техники безопасности, рекомендуемые при работе с кровью в соответствии с Инструкцией по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений, утвержденной Минздравом СССР от 17.01.91 г., и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР». 

 При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять или передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

В состав трансформирующего раствора входит ацетонциангидрин, ядовитое вещество. В случае попадания раствора на кожу и слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается. При попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. 

Другие компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

 ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ

– Спектрофотометр, длина волны 540 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 500–560 нм (зеленый светофильтр), кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;

– пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02 и 5,0 мл;

– колба мерная вместимостью 1,0 л;

– пробирки вместимостью 5–10 мл;

– секундомер;

– вода дистиллированная;

– перчатки резиновые или пластиковые.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Трансформирующий раствор. Один пакет трансформирующего реагента и одну ампулу ацетонциангидрина количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1,0 л, растворить в небольшом количестве дистиллированной воды и довести объем дистиллированной водой до метки.

Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

В пробирки внести по 5,0 мл трансформирующего раствора, добавить по 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18–25° С) в течение 20 минут, после чего измерить величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. 

Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и пробу цельной крови.

Окраска устойчива в течение 1 часа.

Концентрацию гемоглобина в крови рассчитать по формуле:

              Eо

     С = ———  х 120 ,

              Eк

где: С – концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

       Eо – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;

       Eк – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;

       120 – концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 

Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение  наборов при температуре до +25° С не более 5 суток. 

Срок годности набора – 2 года.

Трансформирующий раствор должен  быть прозрачным, желтого цвета и может храниться в посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 6 месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден для употребления. Не замораживать!

Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона может храниться в течение 6 месяцев, но не более срока годности набора, при хранении в укупоренном виде при температуре +2–8° С.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок (495) 777-41-92.

Инструкция составлена:  к.б.н. И.В. Смирновым – ст.н.с. Гематологического научного центра РАМН, к.б.н. Н.Н. Контугановым, В.В. Майоровой – сотрудниками ООО «Агат–Мед».