Гемоглобин гемоглобинцианидный метод эколаб

Гемоглобинцианидным методом

Задание 1.Определить содержание гемоглобина в крови гемоглобинцианидным методом.

Принцип. Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистим калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин.

Ход работы. К 5 мл трансформирующего раствора прибавляют 0,02 мл крови (разведение в 25 раз), хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 мин против холостой пробы (трансформирующего раствора). Определяют оптическую плотность на спектрофотометре при 540 нм в 1 см кювете. Содержание гемоглобина (Х) в г/л рассчитывают по формуле:

Х= D540 × 367,7. При фотометрировании определение проводят в диапазоне волн 500-560 нм (зеленый светофильтр). Эталонный раствор гемоглобина готовят так же, как и пробу цельной крови. Расчет содержания гемоглобина (В) в г/л проводят по формуле: В=(Dоп.×120)/Dэт., где Dоп. – оптическая плотность опытной пробы; Dэт. — оптическая плотность эталонной пробы; 120 — содержание гемоглобина в эталонном растворе (г/л).

Клинико-диагностическое значение. В норме содержание гемоглобина в крови для мужчин составляет 130-160 г/л, для женщин – 120-140 г/л. Определение содержания гемоглобина – необходимый этап диагностики разных заболеваний. Повышение гемоглобина в крови может быть связано со следующими состояниями: 1) заболевания, при которых повышается уровень эритроцитов; 2) повышение кислородной ёмкости крови, вызванное гипоксией при сердечно-сосудистой патологии; проживании в высокогорных районах; ожирении, курении и образовании неактивного гемоглобина; 3) обезвоживание организма; 4) стресс и высокие физические нагрузки; 5) новообразования в почках, печени, ЦНС, яичниках; нарушение функции сосудов; 6) нарушение гормонального уровня (повышение кортикостероидов или андрогенов); 7) химические отравления угарным газом, нитратами или лекарствами; 8) ожоги. Снижение гемоглобина в крови может быть следствием: 1) кровотечений; 2) снижения уровня эритроцитов при разных видах анемий (дефицит витаминов В12 и В9; дефицит витамина С; нехватка железа; интоксикации или нарушение работы почек; нарушение созревания эритроцитов). Снижение гемоглобина могут вызывать разнообразные факторы: неполноценное питание; нарушение работы желудочно-кишечного тракта; употребление большого количества чая, кофе и других продуктов, тормозящих всасывание железа.

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 263-269, 419-423.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 317-323, 502-507.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 553-562.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 78-85, 503-506.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 636-645.

6. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 255-262.

Тема: Обмен гемоглобина; его распад. Биохимия жёлчных пигментов. Желтухи. Количественное определение билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Актуальность. Продолжительность жизни эритроцитов составляет около 120 суток, на протяжении которых они снашиваются и разрушаются; гемоглобин высвобождается и подлежит расщеплению на глобин и гем в селезёнке, костном мозге и купферовских клетках печени. Белковая часть подвергается обычным преобразованиям, присущим простым белкам. Молекула гема подвергается многоступенчатым преобразованиям, конечным продуктом которых является стеркобилин, который выводится с калом и мочой. При распаде гемоглобина образуются жёлчные пигменты (биливердин, билирубин и др). Билирубин вследствие слабой растворимости и токсичности транспортируется альбуминами крови и поступает на синусоидальную поверхность гепатоцитов путём облегчённого транспорта. В печени происходит конъюгация билирубина с глюкуроновой кислотой (УДФГК) под действием фермента УДФ-глюкуронилтрансферазы и преобразование в моно- и дибилирубинглюкурониды. Конъюгированный билирубин путём активного транспорта поступает в жёлчь и дальше в желудочно-кишечный тракт, где происходят его дальнейшие преобразования. Таким образом, существуют две формы билирубина: 1) неконъюгированный, свободный (билирубин-альбумин) и 2) конъюгированный, связанный (билирубинглюкурониды). По предложению Ван ден Берга первый приобрёл название «непрямого» (дает диазореакцию Эрлиха после предварительной обработки метанолом, кофеиновым реактивом), а второй — «прямого» (дает диазореакцию без предварительной обработки). Знание путей распада гемоглобина является важным для будущих врачей в связи с диагностированием разных заболеваний, дифференциальной диагностикой желтух, которые могут быть связаны с заболеваниями печени и ферментопатиями, а также с возможной коррекцией этих нарушений.

Цель. Ознакомиться с ферментативным процессом распада гемоглобина в организме; жёлчными пигментами, которые образуются при этом, их преобразованием и значением исследования в крови, моче и кале. Особое внимание обратить на фракции билирубина и клинико-диагностическое значение их определения в сыворотке крови. Выучить нарушение обмена жёлчных пигментов и факторы, которые их вызывают. Уметь связывать знание теоретического материала с конкретными результатами лабораторных исследований и использовать их как критерии для установления вида той или иной желтухи. Ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина и фракций в сыворотке крови и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Общая схема распада гемоглобина.

2. Жёлчные пигменты, их преобразование, значение исследования в крови, моче и кале.

3. Прямой и непрямой билирубин крови. Значение исследования.

4. Патобиохимия желтух: гемолитическая, паренхиматозная, обтурационная.

5. Ферментативные, наследственные желтухи: синдром Криглера-Найяра (“конъюгированная желтуха”), болезнь Жильбера (“абсорбционная желтуха”), синдром Дабина-Джонсона (“экскреционная желтуха”).

6. Ферментативные желтухи новорожденных, способы их предотвращения и лечения.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Назовите реакции катаболизма гемоглобина, которые протекают в клетках ретикулоэндотелиальной системы.

2. Назовите реакции катаболизма гемоглобина, которые протекают в гепатоцитах.

3. Назовите реакцию катаболизма гемоглобина, которая протекает в кишечнике.

4. Какой из перечисленных жёлчных пигментов не выделяется с мочой?

5. У мужчины, 38 лет, с желтушной кожей отмечается анемия, увеличение селезёнки, гипербилирубинемия (билирубин непрямой), уробилинурия, гиперхоличный кал. Для какого состояния характерны эти изменения?

6. У новорожденного содержание билирубина повышено (за счет непрямого), кал интенсивно окрашен (повышено содержание стеркобилина), в моче билирубин не выявлен. О какой желтухе идёт речь?

7. У больного желтушность кожи, склер, слизистых оболочек. Моча цвета темного пива, кал гипохоличный. В крови повышено содержание билирубина как прямой, так и непрямой фракции, повышена активность АлАТ, ЛДГ4 и ЛДГ5. В моче определяется билирубин. О каком виде желтухи идёт речь?

8. У больного ребенка, 10 лет, выявлены тяжёлые неврологические нарушения, желтушность кожи, в сыворотке крови повышен уровень неконъюгированного билирубина. Вследствие нарушения синтеза какого фермента возникает болезнь Жильбера?

9. Пациент обратился в клинику с жалобами на общую слабость, боли в животе, плохой аппетит, наблюдаются признаки желтухи. В сыворотке крови содержание общего билирубина составляет 77,3 мкмоль/л, а конъюгированного — 70,76 мкмоль/л. Какой наиболее вероятный диагноз?

10. Укажите продукт распада гемоглобина в печени:

11. Укажите белок плазмы крови, который соединяется с гемоглобином при гемолизе эритроцитов:

Дата публикования: 2015-07-22 ; Прочитано: 4191 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2020 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.002 с) .

источник

О гемиглобинцианидном методе определения гемоглобина

Гемоглобин (Hb) – пигмент крови, который вместе с эритроцитами переносит кислород воздуха от альвеол легких к органам-мишеням. Без этого действия невозможна жизнедеятельность человека. Существуют различные состояния и заболевания, при которых показатель снижается. Поэтому в лабораториях используют различные методы для его выявления. Одним из них является гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина. Он имеет положительные и отрицательные стороны, которые учитывает врач перед назначением исследования.

Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:

• феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
• цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
• дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
• не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.

Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный метод проводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный метод с калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.

Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.

Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.

• Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
• Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
• Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
• Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.

Формула для определения количества гемоглобина:

Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10

• Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
• Eст – экстинкция стандартного образца;
• С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
• К – коэффициент разведения биологической жидкости;
• 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
• 10 – число для пересчета г% в г/л.

После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.

Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.

Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.

Плюсы гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина

Исследование с помощью добавления цианида к крови имеет множество положительных сторон:

• исследование унифицировано, то есть считается достоверным, одобрено Комитетом здравоохранения;
• методика позволяет перевести все формы гемоглобина в одну, которую возможно рассчитать с помощью фотоколориметра;
• полученный гемиглобинцианид имеет длину волны 540 м, которую улавливает полуавтоматический оптический прибор для определения показателя;
• использование дешевых реактивов, которые не приносят клиническому учреждению больших финансовых затрат;
• простата методики, которую может выполнить любой врач лаборант;
• большой срок годности реактивов;
• применение незначительного количества реактива для 1 исследования, что позволяет проводить множество анализов за 1 сутки;
• быстрота проведения анализа, которая переводит его в экспресс-метод;
• применение полуавтоматического анализатора, самостоятельно подсчитывающего данные, что снижает риск получения врачебной ошибки.

Минусы гемиглобинцианидного метода определения гемоглобина

Использование цианидных реактивов в лабораторной диагностике устарела. Это вызвано тем, что исследование имеет следующие отрицательные стороны:

• возможность поражения кожных покровов и дыхательных путей врача-лаборанта реактивами;
• наличие более современных методов, которые более безопасны для лаборанта;
• возможность врачебной ошибки в неправильной подборке дозировки реактивов;
• прибор не выдает данные по определению формы или размеров клеток, поэтому для их выявления требуется проведение дополнительных анализов.

Так как цианидные соединения являются вредными для человека, разработан гемихромнй метод. Он полностью безопасен и на данный момент вытесняет гемиглобинцианидную методику из клинической лабораторной диагностики.

Показания к применению гемиглобинцианидного метода

Для проведения методики необходимые показания я ее проведению.

• Плановая диспансеризация пациента, проверка состояния его здоровья. Определение гемоглобина является одним из наиболее частых методик в лабораторной диагностике, так как показатель влияет на состояние множества тканей и органов.
• Наличие заболевания красного костного мозга, которое приводит к снижению количества эритроцитов или сразу всех ростков кроветворения.
• Чрезмерная продукция эритроцитов в красном костном мозге, которая приводит к эритроцитемии. Повышение количества Hb до критических значений не является положительной стороной, состояние требует лечебных мероприятий.
• Подозрение на анемию.
• Определение показателей во время проведения лечебных мероприятий. После получения данных врач может скорректировать дозировку препаратов или заменить их.

Возможные ошибки в применении гемиглобинцианидного метода

Исследование крови с помощью методики может быть неточной. Это вызвано тем, что возможны различные ошибки в ее проведении:

• нарушения в подготовке пациента к исследованию (отсутствие диеты, использование активных физических нагрузок, употребление некоторых категорий лекарств);
• нарушение правил забора крови (резкое изменение положения тела пациента в пространстве, работа кулаком при взятии венозной крови, использование не стерильных инструментов и пробирок);
• отсутствие добавления антикоагулянта, что приводит к образованию сгустка и делает невозможным проведение исследования;
• чрезмерно долгое стояние пробы без проведения исследования;
• неправильная дозировка реактивов, вышедший срок годности химических веществ, неправильно подобранная концентрация жидкости для разведения, отсутствие перемешивания крови после добавления реактива, осуществление исследования без настаивания полученной жидкости после добавления химических веществ;
• ошибка в расчете формулы;
• использование загрязненных приборов или фотоколориметра, что делает проведение исследования невозможным, так как прибор не может рассчитать длину волны.

Для исключения получения неточных данных врач должен назначить несколько исследований. Если оба показателя примерно одинаковы, это говорит о достоверности. Перед назначением анализа врач должен предупредить о подготовительных мероприятиях, которым должен в точности руководствоваться пациент. Это связано с тем, что уровень показателя зависит от состояния организма и воздействующих на него факторов.

Гемиглобинцианидный метод – точная методика, которая использовалась в лабораториях раннее. На данный момент она заменена другими исследованиями, так как применение цианидных компонентов может нанести вред здоровью врача-лаборанта. Несмотря на это, анализ считается наиболее точным и достоверным, поэтому он был унифицирован Комитетом здравоохранения. Методика проста в использовании, реактивы недорогие, анализы проводятся быстро.

Современным и точным методом измерения гемоглобина сегодня является гемихромный метод. Возможно, Вам будет интересно почитать обзор всех методов определения гемоглобина в крови.

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

источник