Гемоглобин в крови гемихромным методом
28 февраля 2019 г.
Гемоглобин (Hb) – молекула, находящаяся в эритроцитах, с помощью которой перемещается кислород. Он поступает из альвеол легких, переносится к органам и клеткам-мишеням. Определение гемоглобина является самым распространенным анализом в лабораториях. Ранее применялись методы на основе цианида, но это вещество является высокотоксичным, поэтому на данный момент применяют гемихромный метод определения гемоглобина.
Суть гемихромного метода определения гемоглобина
Гемоглобин имеет множество различных форм. Для упрощения подсчета его количества пигмент переводят в одну форму – гемихром (HbChr). Он имеет интенсивный красный цвет и длину волны 540 нм, поэтому подсчитывается легко. Его число отображает всю концентрацию Hb в исследуемой жидкости.
Для перевода гемоглобина в гемихром использует реагенты для трансформации:
- четвертичные аммониевые основания с ПАВ;
- соли жирных кислот с добавлением ЭДТА;
- SDS.
Выпускаются новые реагенты, в составе которых отсутствуют цианиды. Они основаны на додецилсульфате натрия. Наилучшим веществом является SDS. Скорость перехода пигмента при его использовании намного выше, чем у других реактивов. Необходимо всего 5 минут. С помощью реагентов возможно использование исследования в качестве экспресс-метода. То есть возможно проведение множества анализов за 1 рабочий день. При этом пациент получает на руки готовый результат в день сдачи биологической жидкости.
В лабораториях часто используют исследования гемоглобина гемихромным методом с помощью реактивов Ольвекс. Он содержит натрия лаурилсульфат, полностью безопасный для врачей. Его достоинством является низкая стоимость при высоком качестве и продолжительном сроке годности.
Материалом для исследования является капиллярная или венозная кровь. Последний вариант используется чаще, так как исследование более достоверно. Узнайте, чем отличается анализ крови из пальца и вены.
В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, например, ЭДТА или гепарин. Это предотвратит образование сгустка.
Исследование проводят в несколько этапов.
- В биологическую жидкость добавляют трансформирующий раствор в соотношении 20:5000 мкл. Полученный образец тщательно перемешивают. Возможно использование центрифуги. Жидкость должна тщательно перемешаться. Реагент воздействует на кровь в течение 5 минут.
- Для определения концентрации гемоглобина используют фотометр. Это оптический прибор, который подсчитывает показатель при длине волны 540 нанометров.
- Результат, полученный с помощью полуавтоматического анализатора, подставляют в формулу C =A×f, где C – концентрация гемоглобина; A – данные, полученные на фотометре; f – фактор, индивидуальный для каждого фотометра.
Полученные данные записывают на бланке исследования, передают пациенту. Он может самостоятельно сравнить результат с нормой. Но для постановки диагноза необходимо обратиться к врачу. Он выявит отклонения, назначит лечение.
На бланке исследования записывается полученные результаты, которые можно сравнить с нормой. Она разнится по возрасту и полу. Данные описаны в таблице.
Возраст | Женский пол, г/дл | Мужской пол, г/дл |
1-3 года | 10,5-12,8 | 10,2-12,6 |
3-6 лет | 10,5-12,9 | 10,3-12,8 |
7-13 лет | 10,5-13 4 | 10,8-13,2 |
От 13 лет и выше | 11,5-15,7 | 14,8-17,4 |
Незначительное отклонение показателя не свидетельствует о появлении заболевания. Отклонение от нормы в меньшую или большую степень на несколько единиц должно быть проверено повторным исследованием. Если результат тот же, врач должен выявить причину состоянии, назначить лечение.
Плюсы гемихромного метода определения гемоглобина
Методика определения Hb с помощью гемихромного метода имеет множество положительных сторон:
- два варианта сдачи крови: забор капиллярной или венозной жидкости;
- экспресс-диагностика, которая позволяет получить результат в день сдачи исследования;
- безопасность для сотрудников лаборатории, так как методика не использует токсические реактивы, которые могут навредить здоровью;
- использование полуавтоматического анализатора, который полностью устраняет риск врачебной ошибки на этапе подсчета клеток;
- простота метода, использование дешевых реактивов, которые экономят деньги клинического учреждения;
- точность полученных показателей, благодаря которым лечащий врач определяет состояние пациента, назначает дополнительные методы диагностики и лечение;
- необходимость использования малого количества крови для анализа, если лаборант решил, что анализ недостоверной, возможно повторное тестирование;
- использование незначительного количества реактивов для одного исследования, что позволяет распределить химические вещества на множество тестирований;
- дешевизна одного реактива, что позволяет клинике закупить множество данных химических веществ.
Минусы гемихромного метода определения гемоглобина
Методика имеет отрицательные стороны, которые учитываются врачом в постановке диагноза:
- возможность врачебной ошибки на этапе сдачи крови;
- возможность неправильного приготовления реактива, использование неверных концентрации для разведения крови;
- отсутствие возможности рассмотреть форму и размер клеток, фотометр определяет только их количество.
Показания к применению гемихромного метода
Методика для подсчета количества гемоглобина проводится в лабораториях постоянно. Для назначения исследования необходимы различные показания.
- Диспансеризация человека для определения состояния его здоровья. В этом случае исследование проводят 1 раз в год.
- Системные заболевания, вызывающие снижение гемоглобина. К ним относят недостаток витаминов и фолиевой кислоты, различные форы анемии, нарушение образования форменных элементов в костном мозге.
- Проверка здоровья беременной женщины. Во время беременности показатели могут быть незначительно или резко снижены. В первом случае терапевтические меры не требуются. Если показатель снижен значительно, назначают препараты, способствующие его повышению, так как дефицит гемоглобина может негативно сказаться на росте формирование плода.
- Проверка количества гемоглобина во время лечения. Врач корректирует дозировку лекарственных препаратов или заменяет их на другие медикаменты.
Возможные ошибки в применении гемихромного метода
Во время проведения методики могут быть допущены ошибки, которые приведут к получению неправильного результата:
- неправильно настроенный прибор, допущение ошибки в его калибровке;
- неверный расчет показателя с помощью формулы;
- неверная дозировка раствора или крови, ошибка в подборе пипеток для взятия определенного количества жидкости;
- стояние полученного образца чрезмерно продолжительное количество времени;
- использование неправильных реагентов или истечения срока их годности;
- использование высоких или низких температур во время исследования;
- ошибка во время забора крови (работа кулаком, резкое перемещение пациента из лежачего состояние в положение сидя);
- отсутствие добавления антикоагулянта, вследствие чего образуется сгусток и проведение анализа невозможно;
- использование загрязненных приборов для хранения, перенесения, исследования биологической жидкости.
Для исключения ошибок в полученных данных врач должен назначать несколько анализов. Если результаты будут схожи, это говорит о правильности исследования. Ошибки могут быть не только в лаборатории, но и в неправильной подготовке пациента. Поэтому врач должен предупредить о необходимых действиях, которые он должен совершить до исследования.
Гемихромный метод определения гемоглобина – исследование последнего поколения, которое предотвращает воздействие токсических веществ на организм врачей-лаборантов. Показатели, полученные с помощью методики достоверны. Определение количества гемоглобина помогает лечащему врачу в постановке диагноза, определении состояния пациента. Важно правильно подготовиться к исследованию, чтобы исключить риск ошибки.
Читайте о том, какие методы определения гемоглобина в крови еще существуют.
Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro
Полезное видео
О гемиглобинцианидном методе определения гемоглобина
Подсчет нейтрофилов – простой, но необходимый анализ
Подсчет лимфоцитов: разновидности метода
Подсчет количества тромбоцитов в крови – подробно о методиках
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемихромным методом
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемихромным в клинико-диагностических и биохимических лабораториях. Набор рассчитан на проведение 1000 определений при расходе 5,0 мл рабочего раствора на один анализ.
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
Гемоглобин крови под действием поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия переходит в низкоспиновую окисленную форму — гемихром, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически при длине волны 540 (500–560) нм.
СОСТАВ НАБОРА
1. Трансформирующий реагент, концентрат — (натрий додецилсульфат, 60 г/л) — 5 флаконов (по 10 мл).
2. Калибровочный раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л — 1 флакон (2 мл).
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Линейная область определения концентрации гемоглобина — в диапазоне от 20 до 200 г/л, отклонение от линейности — не более 2%.
Чувствительность определения — не более 10 г/л.
Воспроизводимость: коэффициент вариации не более 2%.
Нормальные величины концентрации гемоглобина в крови составляют: — у мужчин 130–160 г/л; — у женщин 120–140 г/л. Качество набора можно оценивать с использованием контрольных растворов гемоглобина отечественного или зарубежного производства. Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон нормальных величин у обследуемого контингента.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе кровью и ее компонентами необходимо соблюдать правила техники безопасности принятые в лаборатории, т.к. образцы человеческой крови следует рассматривать как потенциально инфицированные.
ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
— Спектрофотометр, длина волны 540 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны 500–560 нм (зеленый светофильтр), кювета с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм;
— пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,02 и 5,0 мл;
— колба мерная вместимостью 1,0 л;
— пробирки вместимостью 5–10 мл;
— секундомер; — вода дистиллированная;
— перчатки резиновые или пластиковые.
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
Трансформирующий раствор. Содержимое одного флакона концентрата трансформирующего реагента количественно перенести в мерную колбу вместимостью 1,0 л и довести объем дистиллированной водой до метки. Допускается выпадение кристаллов додецилсульфата натрия в концентрате трансформирующего реагента при хранении. Выпавший осадок можно растворить, подогрев концентрат в горячей воде, либо он полностью раствориться при количественном переносе в мерную колбу. Если рабочий раствор трансформирующего реагента не становиться прозрачным после растворения концентрата в течение часа, то такой раствор не пригоден к применению.
Калибровочный раствор гемоглобина готов к применению.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
В пробирки внести по 5,0 мл трансформирующего раствора, добавить по 0,02 мл крови (разведение в 251 раз), тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре (+18–25° С) в течение 20 минут, после чего измерить величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500–560) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывать так же, как и пробу цельной крови. Окраска устойчива в течение 1 часа. Концентрацию гемоглобина в крови рассчитать по формуле:
Eо
С = —————— х 120 ,
Eк
где: С — концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;
Eо — оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плотн.;
Eк — оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотн.;
120 — концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–8° С в течение всего срока годности. Допускается хранение наборов при температуре до +25° С не более 5 суток.
Срок годности набора — 2 года.
Трансформирующий раствор должен быть прозрачным и может храниться при комнатной температуре не более 1 месяца. При появлении осадка раствор непригоден для употребления.
Калибровочный раствор гемоглобина после вскрытия флакона может храниться в течение 6 месяцев, но не более срока годности набора, при хранении в укупоренном виде при температуре +2–8° С.
По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат—Мед». Телефон для справок: (495) 777-41-92.
Инструкция составлена: к.б.н. И.В. Смирновым — ст.н.с. Гематологического научного центра РАМН.
Назад к списку инструкций
[13-165]
Электрофорез гемоглобина для диагностики гемоглобинопатий
2900 руб.
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов): 2α и 2β, каждая из которых связана с гемом. Гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Посредством электрофореза гемоглобина можно проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Синонимы английские
Serum Hemoglobin Electrophoresis.
Метод исследования
Электрофорез и денситометрия.
Единицы измерения
Мг/дл (миллиграмм на децилитр).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Венозную кровь.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Не курить в течение 30 минут до исследования.
Общая информация об исследовании
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет определить процентное содержание основных изоформ гемоглобина и провести скрининг гемоглобинопатий. В норме в крови взрослого человека не менее 96,5 % гемоглобина представлено изоформой HbA, которая состоит из двух пар полипептидных цепей (глобинов) – 2α и 2β, – каждая из которых связана с гемом. HbA обеспечивает адекватный газообмен и тканевую оксигенацию. Фракция HbA2 – второстепенная форма гемоглобина, имеет формулу 2α2δ. Также у взрослого допустимо наличие следовых количеств фетального гемоглобина HbF (2α2γ), который является преобладающей фракцией в течение внутриутробного периода. В течение первых 6 месяцев жизни HbF замещается HbA.
Нарушения структуры гемоглобина обычно разделяют на две группы: гемоглобинопатии и талассемии, хотя талассемии являются формой гемоглобинопатии. Талассемии представляют собой нарушения синтеза α-, β- или обеих цепей гемоглобина. Также могут отмечаться нарушения синтеза δ-, γ- цепей. Большинство вариантов α- и β-талассемий сопровождается изменением уровня HbF и HbA2, поэтому определение этих изоформ может быть использовано для скрининга этих состояний.
Остальные гемоглобинопатии связаны с наличием аномального варианта гемоглобина. Наиболее распространённые и клинически значимые аномальные варианты гемоглобина: S, D, E, C. Варианты HbS и HbD – патологические формы гемоглобина, которые обладают идентичной миграцией в щелочном геле и являются результатом точечных мутаций гена, кодирующего β-глобин. Варианты Е и С при данном методе мигрируют в составе фракции HbA2, при их наличии фракция HbA2 достигает более 25 %. Наибольшее клиническое значение представляет HbS-вариант, который приводит к серповидноклеточной анемии.
Электрофорез гемоглобина в щелочном геле позволяет проводить скрининг состояний, связанных со структурными аномалиями гемоглобина. При этом метод не позволяет установить тип и характер гемоглобинопатии.
Электрофорез является чувствительным методом, с помощью которого можно исключить гемоглобинопатии либо определить тактику дальнейшего обследования для установления точного диагноза заболевания. Метод характеризуется высокой внутрипостановочной (SD
Метод исследования основан на электрофорезе гемоглобина, полученного при лизисе отмытых эритроцитов обследуемого. После разделения гемоглобина на фракции производится окрашивание зон миграции. Содержание гемоглобина в составе фракций измеряется с помощью цифровой денситометрии.
Когда назначается исследование?
- Скрининг гемоглобинопатий;
- наличие семейного анамнеза гемоглобинопатий, планирование семьи;
- микроцитарная анемия, не связанная с дефицитом железа;
- гемолитическая анемия неустановленной этиологии;
- обнаружение изменённых эритроцитов (серповидная деформация) при микроскопическом исследовании крови.
Что означают результаты?
Референсные значения
Гемоглобин A | ≥ 96,5% |
Гемоглобин A2 | |
Гемоглобин F | |
Гемоглобин S/D | 0 % |
Важные замечания
- Тест обладает высокой достоверностью при скрининге β-талассемий, вариантов, приводящих к серповидноклеточной анемии, и синдромов персистенции фетального гемоглобина.
- При использовании данного метода может быть затруднена индентификация α+-талассемии (талассемия с одной мутацией).
Также рекомендуется
02-029 Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с микроскопией мазка крови при выявлении патологических изменений)
06-276 Гепсидин-25
06-017 Железо в сыворотке
Кто назначает исследование?
Гематолог, терапевт, врач общей практики.