Качественная реакция на обнаружение гемоглобина проба тейхмана

Химия Геминовая проба Тейхмана

Количество просмотров публикации Геминовая проба Тейхмана – 635

КАТЕГОРИИ:

АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Стеклянной палочкой нанесем на предметное стекло капельку крови, размажем ее и высушим на воздухе. Затем нанесем на это стекло, тонким слоем измельченную до мельчайшего порошка поваренную соль, добавим 1—2 капли ледяной уксусной кислоты (в крайнем случае можно взять вместо нее уксусную кислоту высокой концентрации) и наложим сверху покровное стекло. Нагреем предметное стекло слабым (!) пламенем до образования первых пузырьков (ледяная уксусная кислота кипит при 118,1 °С). Затем при осторожном нагревании полностью выпарим уксусную кислоту. После охлаждения рассмотрим пробу под микроскопом с увеличением в 300 раз. Мы увидим красно-коричневые ромбические таблички (призмы). Если такие кристаллы не образовались, то снова нанесем уксусную кислоту на границу соприкосновения стекол, дадим ей просочиться внутрь и снова нагреем предметное стекло.

Эта реакция позволяет обнаружить следы высохшей крови и на ткани. Для этого обработаем такое пятно водой, содержащей углекислый газ, например минеральной водой, профильтруем вытяжку, фильтрат упарим на предметном стекле и далее обработаем пробу так же, как указано выше. Впервые синтезировать и расщепить гемин удалось немецкому химику Гансу Фишеру в 1928 г. Сравнение формулы гемина (или гема) с формулой зеленого пигмента растений хлорофилла свидетельствует об удивительном сходстве этих соединений:

Обнаружение крови с использованием бензидина

Бензидиновая проба тоже позволяет обнаружить незначительное количество крови. Вначале приготовим реактив. Для этого 0,5 г бензидина растворим в 10 мл концентрированной уксусной кислоты и разбавим раствор водой до 100 мл. К 1 мл полученного раствора прильем 3 мл 3 %-ного раствора пероксида (перекиси) водорода и тотчас смешаем с очень разбавленной водной вытяжкой крови. Мы увидим зеленое окрашивание, которое быстро переходит в синее.

В 5 л крови, содержащейся в организме человека, находится 25 биллионов красных кровяных телец, а в них — от 600 до 800 г гемоглобина. К 1 г чистого гемоглобина может присоединиться около 1,3 мл кислорода. Однако к гемоглобину может присоединяться не только кислород. Его сродство к оксиду углерода (угарному газу) в 425 раз больше, чем к кислороду. Образование более прочного соединения оксида углерода с гемоглобином приводит к тому, что кровь теряет способность переносить кислород, и отравленный человек задыхается. Поэтому будем осторожны с бытовым газом и другими газами, содержащими оксид углерода!

Теперь мы знаем, что при обмене веществ кровь играет важнейшую роль транспортного средства. Перенос газов, удаление чужеродных веществ, заживление ран, транспортировка питательных веществ, продуктов обмена, ферментов и гормонов являются главными функциями крови. Вся пища, которую человек съедает, подвергается в желудке и кишечнике химической переработке. Эти превращения осуществляются под действием особых пищеварительных соков — слюны, желудочного сока, желчи, поджелудочного и кишечного сока. Активным началом пищеварительных соков являются, главным образом, биологические катализаторы — так называемые ферменты, или энзимы. Например, ферменты пепсин, трипсин и эрепсин, а также сычужный фермент химозин, действуя на белки, расщепляют их на простейшие фрагменты — аминокислоты, из которых организм может строить свои собственные белки. Ферменты амилаза, мальтаза, лактаза и целлюлоза участвуют в расщеплении углеводов, тогда как желчь и ферменты группы липаз способствуют перевариванию жиров.

Действие желчи

Влияние желчи на переваривание жиров можно подтвердить следующим опытом. В две одинаковые склянки или колбы Эрленмейера вставим стеклянные воронки. В каждой из воронок слегка увлажним полоску фильтровальной бумаги водой. Затем в одной из воронок пропитаем бумагу желчью (коровьей, свиной или гусиной) и в обе воронки нальем по несколько миллилитров пищевого растительного масла. Мы увидим, что масло проникает только в ту полоску бумаги, которая была обработана желчью. Дело в том, что желчные кислоты вызывают эмульгирование жиров, дробление их на мельчайшие частицы. Поэтому желчь помогает в организме ферментам, способствующим перевариванию жиров. Особенно наглядно это проявляется в следующем опыте.

«Искусственный желудок»

Если удастся найти свиной желудок, его нужно вывернуть, промыть водой и тупым ножом соскоблить слизистую оболочку в химический стакан. Туда же нальем четырехкратное количество 5 %-ного этанола и оставим стакан на 2 дня. Полученную водно-спиртовую вытяжку профильтруем через кусок ткани. Фильтрование можно существенно ускорить с помощью отсасывания на нутч-фильтре водоструйным насосом. Вместо приготовления такой вытяжки можно купить в аптеке пепсин в порошке и растворить его в 250 мл воды.

В заключение натрем на терке белок куриного яйца, сваренного вкрутую (кипятить 10 минут), и смешаем его в химическом стакане со 100 мл воды, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и приготовленной вытяжкой, содержащей пепсин, или же с 50 мл раствора продажного пепсина. Соляную кислоту нужно добавить потому, что пепсин действует только в кислой среде — при рН от 1,4 до 2. Величина рН желудочного сока благодаря присутствию в нем соляной кислоты находится в пределах от 0,9 до 1,5.

Стакан выдержим несколько часов при температуре приблизительно 40 °С в теплом месте — дома около плиты иди печи либо в лаборатории в сушильном шкафу. В течение первой четверти каждого часа содержимое стакана будем перемешивать стеклянной палочкой. Уже через 2 часа мы заметим, что количество белка существенно уменьшилось. Через 6—8 часов весь белок растворится и образуется малое количество белой со слабым желтоватым оттенком кожицы. При этом яичный белок, имеющий сложное строение, гидролизуется водой и превращается в смесь соединений более простого строения — яичный пептон. То, чего химик может добиться только с помощью концентрированных кислот, нам в нашем искусственном желудке удалось осуществить при исключительно мягких условиях.

Неприятный кислый запах содержимого стакана близок к запаху неполностью переваренной пищи.

Теперь проведем самостоятельно еще несколько пробирочных опытов, связанных с исследованием переваривания пищи. Некоторые из них заслуживают краткого пояснения.

Расщепление крахмала можно провести в пробирке при действии слюны на жидкий крахмальный клейстер (37 °С, 30 минут —1 час). Образующийся сахар обнаруживается с помощью реактива Фелинга. Тот же результат можно получить при нагревании 10 мл крахмального клейстера с 5 мл вытяжки коровьей поджелудочной железы в течение 15 минут на водяной бане при 40 0С. Вытяжку готовят путем растирания поджелудочной железы с малым количеством пропантриола (глицерина).

Такая кашица из поджелудочной железы пригодится и для исследования переваривания жиров. С этой целью в пробирку, наполовину заполненную цельным молоком, добавим 0,5%-ный раствор соды (карбоната натрия) до появления красного окрашивания с фенолфталеином. Если теперь добавить кашицу из поджелудочной железы и нагреть на водяной бане до 40 °С, то красное окрашивание снова исчезнет. При этом из жира натурального молока образуются свободные жирные кислоты. В заключение, используя сычужный фермент (сычужную закваску) или полоску очищенной слизистой оболочки телячьего желудка, мы можем выделить из сырого молока белок казеин. Химики и биологи открыли сотни интересных реакций, позволяющих обнаружить самые разнообразные вещества, содержащиеся в организме. С некоторыми из этих реакций мы познакомимся.



К гемпротеидам относят гемоглобин, миоглобин, цитохромы и ферменты – каталазу и пероксидазу. Они состоят из белковой части и гема, представляющего собой тетрапиррольное соединение, связанное с атомом железа (II).

При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты в присутствии NaCl гем переходит в гемин, в котором железо трехвалентно и его третья валентность связана с хлором. При действии на гемоглобин щелочей гем переходит в гематин, в котором атом железа также трехвалентен, и третья его валентность связана с гидроксильной группой.

Гем, входящий в гемоглобин, ускоряет реакцию окисления субстратов (S·H2) пероксидом водорода, т.е. действует подобно ферменту пероксидазе: S·H2 + H2O2 – S + 2H2O. Это объясняется сходством строения простетических групп гемоглобина и пероксидазы. Однако в отличие от фермента гемоглобин сохраняет каталитические свойства при кипячении и действии сильных кислот, которые вызывают денатурацию белка.

Если в исследуемом материале содержится кровь, то ее присутствие можно обнаружить по способности геминовой группы катализировать окисление подходящих субстратов (бензидин, гвояковая смола) пероксидом водорода.

Реактивы. Пероксид водорода, 3%-ный свежеприготовленный раствор; бензидин, 5%-ный свежеприготовленный раствор в ледяной уксусной кислоте; гваяковая смоляная кислота, 1%-ный раствор на 95%-ном этиловом спирте, свежеприготовленный; азотная кислота, конц.; соляная кислота, не содержащая железа, 10%-ный раствор; гексацианоферрат (II) калия, 2,5%-ный раствор; роданид аммония, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив*; ацетон, подкисленный соляной кислотой (3 мл 2 М раствора HCl на 1 л ацетона, рН≈2), охлажденный в холодильнике.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги шириной 1 см; глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 и 10 мл; штатив; простые и центрифужные пробирки; водяная и песчаная бани; центрифуга с центрифужными весами; тигель фарфоровый и тигельные щипцы.

Материал.

1. Цельная кровь, разведенная в 5000 раз дистиллированной водой.

2. Кровь дефибринированная.

3. Гемоглобин кристаллический, 1%-ный водный раствор.

а. Бензидиновая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления бензидина в дифенохинондиимин пероксидом водорода

Дифенохинондиимин конденсируется с молекулой неокисленного бензидина с образованием окрашенного комплекса сине-зеленого цвета.

В пробирку наливают 1 мл цельной крови, разведенной в 5000 раз, кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают и добавляют по 2 капли раствора бензидина и пероксида водорода. Отмечают появление окрашивания.

б. Гваяковая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления гваяковой смоляной кислоты пероксидом водорода до ее озонида, окрашенного в синий цвет.

Ход определения. В пробирку вносят несколько капель цельной крови (разведенной в 5000 раз) и кипятят ее в течение 1 мин на водяной бане. После охлаждения приливают к пробе 1-2 капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и 3 капли раствора пероксида водорода. Отмечают развитие окрашивания.

в. Проба с гексацианоферратом (II) калия и роданидом аммония на железо гемоглобина. Метод основан на способности железа, входящего в гемоглобин, образовывать с гексацианоферратом (II) калия в присутствии соляной кислоты сине-зеленое комплексное соединение – берлинскую лазурь:

4FeCl3 + 3K4[Fe(CN)6] → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ,

гексацианоферрат (II) берлинская

калия лазурь

а с роданидами – роданид железа розового или красного цвета:

FeCl3 + 3NH4CNS → Fe(CNS)3 + 3KCl

роданид роданид

аммония железа

Ход определения. Несколько капель дефибринированной крови помещают в фарфоровую чашечку (тигель) и выпаривают досуха на песчаной бане. Сухой остаток озоляют, добавляют 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и продолжают нагревание (под тягой). При этом железо гемоглобина переходит в состав золы.

Сухой остаток переносят в пробирку, добавляют 10 капель раствора соляной кислоты до растворения золы. Разливают содержимое примерно поровну в две пробирки. В одну из них добавляют 2 капли раствора гексацианоферрата (II) калия. Наблюдают за появлением характерного окрашивания. Во вторую пробирку приливают 2 капли раствора роданида аммония и отмечают развитие специфического окрашивания.

г. Разделение гемоглобина на гем и глобин. Метод основан на способности ацетона, подкисленного соляной кислотой, разрывать связи между гемом и глобином, причем отщепившийся гем растворяется в ацетоне, а глобин выпадает в осадок.

Ход определения. В пробирку наливают 10 мл подкисленного ацетона и медленно добавляют 10 капель раствора гемоглобина. Наблюдают появление беловатой взвеси (глобин), которая постепенно оседает. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, переливают в центрифужные пробирки и центрифугирую при 1500 об/мин в течение 5 мин.

После центрифугирования в верхний слой (ацетоновый) осторожно опускают две полоски фильтровальной бумаги и проделывают реакции на наличие геминовой группировки. Для этого на одну полоску наносят по капле бензидина и раствора пероксида водорода (бензидиновая проба), на вторую –по две капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и раствора пероксида водорода (гваяковая проба). Отмечают постепенное появление характерного окрашивания на обеих полосках бумаги.

Верхний слой жидкости осторожно сливают, а к оставшемуся осадку добавляют 1 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия. Перемешивают содержимое и добавляют 10 капель биуретового реактива. Наблюдают появление характерного окрашивания.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

В выводах указать на возможность обнаружения гемоглобина в исследуемом материале с помощью проделанных качественных реакций и разделения его компонентов действием кислых растворов ацетона; отметить значение реакций для практики.

Практическое значение работы. Основная часть гемпротеидов крови находится в виде гемоглобина эритроцитов. В сыворотке или плазме крови содержится лишь незначительное количество гемпротеидов, появляющихся при значительном распаде эритроцитов (гемолизе). В сыворотке крови железо находится в виде ферротрансферина, являющегося сложным белком (металлопротеидом), который переносит железо между тканями и органами.

Качественные реакции на простетические группы протеидов позволяют выявить структурные компоненты: геминовую группировку и входящее в состав гема железо. Для обнаружения следов крови очень чувствительные бензидиновая и гваяковые пробы используются в клинике и судебно-медицинских исследованиях.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте: