Кривые диссоциации кислорода для гемоглобина и миоглобина

ЧАСТЬ I. КОНФОРМАЦИЯ И ДИНАМИКА

ГЛАВА 4. ГЕМОГЛОБИН: АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЙ БЕЛОК

4.2. Кооперативность связывания кислорода гемоглобином

Отношение занятых кислородом участков связывания к их общему числу представляет собой степень насыщения, или просто насыщение гемоглобина кислородом, и обозначается У. Значение У изменяется от 0 (все участки свободны) до 1 (все участки заняты). График зависимости У от парциального давления кислорода рO2 называется кривой диссоциации кислорода. Кривые диссоциации кислорода для гемоглобина и миоглобина различаются в двух отношениях (рис. 4.2 и 4.3). Во-первых, при любом рO2 для миоглобина насыщение У выше, чем для гемоглобина. Другими словами, миоглобин обладает более высоким сродством к O2, чем гемоглобин. Сродство к кислороду характеризуют величиной Р50, численно равной парциальному давлению кислорода, при котором насыщены 50% участков связывания (т.е. У= 0,5). Для миоглобина Р50 составляет обычно 1 торр, а для гемоглобина-26 торр.

Рис. 4.2. Диссоциационная кривая кислорода для миоглобина и гемоглобина. Насыщенность участков, связывающих кислород, показана как функция парциального давления кислорода в окружающем растворе

Рис. 4.3. Кривая диссоциации кислорода для гемоглобина. На оси абсцисс отмечены значения pO2, характерные для капилляров работающей мышцы и для альвеол легких. Обратите внимание, что Р50 для гемоглобина в физиологических условиях лежит между этими величинами

Торр-единица давления, численно равная тому давлению, которое производит столбик ртути высотой 1 мм при 0°С и стандартном ускорении силы тяжести (1 мм Hg). Названа в честь Эванджелисты Торричелли (1608-1647), изобретателя ртутного барометра.

Второе различие состоит в том, что кривая диссоциации кислорода в случае миоглобина имеет гиперболическую форму, а в случае гемоглобина-сигмоидную. Как будет указано ниже, сигмоидная форма кривой идеально соответствует физиологической роли гемоглобина как переносчика кислорода в крови. На молекулярном уровне сигмоидность формы означает, что связывание кислорода гемоглобином происходит кооперативно, т. е. присоединение кислорода к одному гему облегчает его присоединение к остальным.

Рассмотрим кривые диссоциации кислорода с количественной стороны, начав с миоглобина как более простого. Связывание кислорода с миоглобином (МЬ) описы-

вается следующим уравнением:

МbO2 ⇄Мb + O2. (1)

Константа равновесия процесса диссоциации оксимиоглобина составит

где [МbO2]- концентрация оксимиоглобина, [Мb]-концентрация дезоксимиоглобина, [O2]- концентрация свободного кислорода, причем все эти величины выражены в молях на литр. Степень насыщения У определяется как

Производя замещения в уравнении (3) на основе равенства (2), получаем

Поскольку O2 – это газ, удобнее выражать его концентрацию в виде рO2, т.е. парциального давления кислорода (в торрах) в окружающей раствор атмосфере. Тогда уравнение (4) принимает следующий вид:

Уравнение (5) графически выражается гиперболой. В самом деле, кривая диссоциации кислорода, рассчитанная по уравнению (5) при Р50, равном 1 торр, хорошо соответствует экспериментальной кривой, полученной для миоглобина.

В отличие от этого для гемоглобина кривая диссоциации кислорода имеет сигмоидную форму и не совпадает ни с одной кривой, описываемой уравнением (5). Это свидетельствует о кооперативном связывании О2 молекулой гемоглобина. Рассмотрим крайний случай, когда имеются только дезоксигемоглобин и гемоглобин (Нb), содержащий 4 связанные молекулы O2:

Нb(O2)4 ⇄ Нb + 4O2. (6)

Константа равновесия этой гипотетической реакции составит

(7)

и далее

(8)

Графически уравнение (8) выражается сигмоидной кривой (рис. 4.4). Заметим, однако, что расчетная кривая идет круче, чем кривая, полученная экспериментально. Другими словами, схема процесса, описанная уравнением (6), является крайностью.

Рис. 4.4. Кривая насыщения гемоглобина кислородом лежит между диссоциационными кривыми, рассчитанными для n — 1 (некооперативное связывание) и n = 4 (полностью кооперативное связывание)

Как же тогда охарактеризовать процесс связывания с промежуточной степенью кооперативности? В 1913 г. Арчибальд Хилл показал, что кривая, построенная по данным определения связывания кислорода гемоглобином, описывается уравнением, соответствующим гипотетическому процессу:

Нb(O2) n ⇄ Нb + nO2. (9)

Насыщение У в этом случае составит

(10)

После преобразований получим

(11)

Последнее уравнение показывает, что отношение оксигема (У) к дезоксигему (1 — У) равно возведенному в n-ю степень отношению рO2 к Р50. Прологарифмируем это уравнение:

(12)

Подчеркнем, что зависимость Ig [У/(1— — У)] от Ig pO2 выразится прямой с углом наклона n. Такой график называется графиком Хилла, а величина наклона n в точке полунасыщения кислородом (У=0,5) составляет коэффициент Хилла.

Миоглобин дает линейный график Хилла с n = 1, 0, тогда как гемоглобин-с n = 2,8 (рис. 4.5). Наклон, равный 1,0, означает, что молекулы кислорода присоединяются к миоглобину независимо друг от друга, как это описано в уравнении (1). С другой стороны, коэффициент Хилла, равный 2,8, указывает на кооперативное связывание кислорода гемоглобином. Присоединение O2 к одному гему облегчает присоединение кислорода к другим гемам того же тетрамера, и обратно: отщепление кислорода от одного гема облегчает его отщепление от остальных. Другими словами, в молекуле гемоглобина имеется взаимосвязь между гемами. Кооперативность связывания кислорода гемоглобином называют иногда взаимодействием гем—гем. Механизм его мы обсудим ниже.

Рис. 4.5. График Хилла для связывания кислорода миоглобином и гемоглобином. Наклон 2,8 для гемоглобина свидетельствует о кооперативном связывании кислорода; миоглобин, напротив, связывает кислород некооперативно, о чем свидетельствует наклон кривой, равный 1,0

Этот график – кривая диссоциации оксигемоглобина, или сатурационная кривая, показывает, какая доля гемоглобина в данной крови связана с О2 при том или ином его парциальном давлении, а какая – диссоциирована, т.е. свободна от кислорода. КДО имеет S-образную форму. S-образный вид КДО указывает на кооперативный характер взаимодействия О2 с Hb. При соединении или отдаче одной молекулы О2 отмечаются функциональные изменения остальных субъединиц Hb в тетрамере.Такая её конфигурация, имеет определенный физиологический смысл, заключающийся в том, что оксигенация крови в легких сохраняется на высоком уровне даже при относительно низком альвеолярном pO2, а её деоксигенация существенно изменяется даже при небольшом изменении капиллярно-тканевого градиента pO2. Плато кривой характерно для сатурированной О2 (насыщенной) артериальной крови, а крутая нисходящая часть кривой – венозной, или десатурированной крови в тканях (рис. 2.4.).

В качестве показателя CГK принимается значение pО2, при котором Hb наполовину насыщается О2, обозначаемая p50, равна 26-28 мм рт.ст. При повышении СГК p50 уменьшается, а при снижении – повышается. Традиционно полагают, что сдвиг КДО вправо повышает отдачу кровью кислорода тканям, а влево затрудняет десатурацию крови в микроциркулярном русле.

На кривой выделяют 3 участка: от 0 до 10 мм рт. ст. – прямо пропорциональная зависимость, от 10 до 50 – насыщение очень быстрое, от 60 до 90 – насыщение почти не изменяется. При рО2 в артериальной крови, равном 96 мм рт. ст., % насыщения гемоглобина кислородом составляет 97%, а в венозной крови с рО2, равным 40 мм рт. ст., % насыщения гемоглобина равен 75%.

Значение S-образной формы кривой:

1) Крутой наклон среднего участка, соответствующий напряжениям О2 в тканях (35 мм рт. ст. и ниже), благоприятствует отдаче О2 в них.

2) Пологая часть, КДО соответствующая высоким напряжениям О2, обеспечивает стабильность тканевого рО2в условиях, когда рО2 артериальной крови может уменьшаться: при подъеме в горы или на самолете, при заболеваниях легких, с возрастом. Даже когда альвеолярное рО2 снижается до 60 мм рт. ст., гемоглобин в артериальной крови все еще насыщен О2 на 89%, что только на 8% ниже нормальной 97% сатурации.

3) С другой стороны, когда альвеолярное рО2 увеличивается до 500 мм рт. ст. (при вдыхании воздуха под повышенным давлением, например, на глубине моря или в компрессионных камерах), насыщение гемоглобина кислородом также изменяется мало – максимум на 3%.

Следовательно, при варьировании альвеолярного рО2 от 60 до 500 мм рт. ст. рО2 в тканях изменяется только на несколько мм рт. ст., т.е. гемоглобин буферирует сдвиги тканевого рО2.

В настоящее время принято оценивать положение КДО не по наклону кривой, а по расположению на ней двух точек. Первая соответствует 50%-ному насыщению гемоглобина кислородом – Р50 – напряжение полунасыщения (точка разрядки по Крогу). В норме при рН = 7,4 и t = 37оС, Р50 артериальной крови 26 мм рт. ст. (3,46 кПа). Оно выше у женщин, чем у мужчин. Напряжение разрядки достаточно высоко, что обеспечивает эффективный градиент рО2 между капиллярами и тканями, где рО2 не более 10-15 мм рт.ст. Вторая точка соответствует 95%-ному насыщению гемоглобина кислородом – Р97 – точка зарядки. В норме Р97 артериальной крови 70 мм рт. ст.

КДО может занимать различное положение, характеризующееся смещением ее средней части вправо или влево (рис.2.5. ).

Сдвиги кривой диссоциации

Традиционно полагают, что сдвиг КДО вправо повышает отдачу кровью кислорода тканям, а влево затрудняет десатурацию крови в микроциркулярном русле.

Смещение влево сопровождается снижением Р50 и повышением сродства гемоглобина к О2 (СГК), а вправо – увеличением Р50 и уменьшением СГК.

Сродство кислорода к гемоглобину и способность отдавать О2 в тканях зависит от метаболических потребностей клеток организма и регулируется важнейшими факторами метаболизма тканей, вызывающими смещение кривой диссоциации(рис.2.6.). К этим факторам относятся: концентрация водородных ионов, температура, парциальное напряжение углекислоты и соединение, которое накапливается в эритроцитах – это 2,3-дифосфоглицератфосфат (ДФГ).

Факторы, влияющие на СГК.

По механизму действия их делят на 2 группы: прямые и косвенные.

Прямое влияние оказывают химические вещества, которые могут взаимодействовать с гемоглобином и изменять конформацию его молекулы. Это лиганды (О2, Н+, СО2, органические и неорганические соли).

Косвенное действие оказывают физические факторы (tо, pH), которые изменяют условия взаимодействия Hb с лигандами.

Рассмотрим первую группу факторов:

I. В 1907 C.Bohru, A.Krogh установили зависимость положения КДО от содержания СО2 в крови. Сначала “эффект Бора” связывали только с СО2. Однако затем J.Barcroft (1909) показал, что подобная связь существует и при воздействии других кислот. В настоящее время эффект Бора рассматривается как влияние рН среды на взаимодействие атома Fe2+ с различными лигандами.

При снижении рН (увеличении [Н+]) СГК падает. Поэтому КДО смещается вправо. Уменьшение оксигенации Hb при снижении рН – эффект Рута.

Описанные эффекты объясняются тем, что при изменении рН происходит сдвиг константы диссоциации и конформации групп, связанных с О2 в тетрамере гемоглобина. В результате этого меняется СГК. Различают респираторный и метаболический компоненты эффекта Бора.

Метаболический – связан с изменением рН под влиянием кислых или щелочных продуктов обмена веществ.

Респираторный – связан с влиянием СО2 на КДО. Образующийся при тканевом метаболизме СО2 диффундирует внутрь эритроцитов, где под влиянием карбоангидразы образуется Н2СО3 = Н+ + НСО3־. Образующиеся при ее диссоциации Н+ приводят к снижению рН. Это рН-зависимый эффект СО2. Однако СО2 также образует карбаминовые связи с концевыми группами a и b цепей гемоглобина, способствуя таким образом стабилизации дезоксиформы гемоглобина. Это рН-независимый эффект СО2.

На выраженность эффекта Бора влияют:

1) органические фосфаты – при повышении содержания 2,3-дифосфоглицериновой кислоты (2,3-ДФГ) падает коэффициент Бора, который определяют как D log Р50 / D log рН; 2) температура; 3) насыщение крови О2;

4) электролиты; 5) свойства Hb; 6) пол – коэффициент Бора меньше у мужчин, чем у женщин.

Т.о., эффект Бора – это результат сложного взаимодействия рН, СО2, 2,3-ДФГ и всех других указанных факторов.

Биологический смысл эффекта Бора: он способствует поглощению О2 в легких и отдаче его в тканях.

В легких – поглощение О2 идет одновременно с выделением СО2, поэтому по мере насыщения гемоглобина кислородом КДО сдвигается влево (рис. 2.6), т.е. СГК возрастает. В результате скорость диффузии О2 из альвеол в кровь несколько увеличивается.

В тканях – одновременно с выходом О2 в эритроциты поступает СО2, поэтому КДО смещается вправо, что приводит к снижению СГК и благоприятствует отдаче О2 тканям.

II. В 1967 г. была описана специфическая роль органичнских фосфатов в эритроцитах. 2,3-ДФГ, значительно уступая АТФ в энергетической ценности, играет огромную роль в регуляции транспорта О2. Во-первых, он взаимодействует с b-цепями восстановленного гемоглобина благодаря соответствию зарядов некоторых аминокислотных остатков распределению зарядов в органическом фосфате. После образования связи с b-цепью 2,3-ДФГ закрывает вход в центральный канал молекулы, что уменьшает СГК. Во-вторых, 2,3-ДФГ также изменяет внутриклеточный рН.

На реакцию 2,3-ДФГ и гемоглобина влияют:

1) соотношение Hb/HbО2 – чем оно выше, тем больше связывается 2,3-ДФГ);

2) рН – снижение рН увеличивает сродство гемоглобина к 2,3-ДФГ;

3) рСО2– уменьшение рСО2 повышает сродство гемоглобина к 2,3-ДФГ;

4) tо– возрастание tо препятствует присоединению 2,3-ДФГ к гемоглобину;

5) анионы – могут конкурировать с 2,3-ДФГ за одни и те же центры связывания.

С изменением содержания 2,3-ДФГв эритроцитах связана зависимость СГК от их возраста – молодые эритроциты имеют меньшее СГК, по мере старения оно возрастает, поскольку уровень 2,3-ДФГ уменьшается.

Роль 2,3-ДФГ в качестве регулятора положения КДО заключается не только во влияниии на СГК. Он служит посредником других влияний – рН, рСО2, t, ионного состава на кислородтранспортную функцию крови.

III. Органические и неорганические соли – при увеличении их концентрации КДО сдвигается вправо. Соли влияют через эритроцитарный метаболизм.

К косвенным факторам, как уже отмечалось, относят рН, влияние которого на СГК рассмотрено выше, и tо. Уменьшение tо увеличивает интенсивность образования HbО2, т.е. при прочих равных условиях смещает КДО влево. Повышение tо, напротив, снижает СГК.

Температурный коэффициент, представляющий собой отношение D log рО2 / D tо, зависит от рН, [2,3-ДФГ], насыщения крови кислородом. Он различен у мужчин и женщин. Оксигенация гемоглобина является экзотермической реакцией, соответственно диссоциация оксигемоглобина протекает с поглощением тепла. При повышении температуры крови происходит снижение СГК и его увеличение при снижении температуры. Алкалоз и гипотермия повышают сродство гемоглобина к кислороду. В этих условиях гемоглобин жадно присоединяет к себе кислород в легких и неохотно отдает его тканям.

При ацидозе и гипертермии в эритроцитах сродство гемоглобина к кислороду снижается. При этом насыщение гемоглобина кислородом в легких ухудшается, но отделение кислорода от оксигемоглобина в капиллярах облегчается.

Особый интерес для изучения кислородсвязывающих свойств крови представляет выделение NO клетками эндотелия кровеносных сосудов.

В целом, дыхательный цикл можно рассматривать как механизм транспорта “трех газов”: NO/О2/CО2 . Характерной особенностью NO является способность быстро (менее чем за 5 секунд) диффундировать через мембрану синтезировавшей его клетки в межклеточное пространство и легко (без участия рецепторов) проникать в клетки-мишени. В результате взаимодействия NO и гемоглобина происходит образование его различных NO-форм: метгемоглобин, нитрозилгемоглобин, нитрозогемоглобин, которые играют роль своеобразного аллостерического регулятора функциональной активности гемоглобина на уровне отдельных его тетрамеров. Присутствие этих соединений гемоглобина с NO может по-разному влиять на СГК всей крови: метгемоглобин и нитрозогемоглобин его повышают, а нитрозилгемоглобин снижает. В ходе одного цикла движения эритроцита в сосудистой системе происходят последовательные реакции гемоглобина с NO, модулирующиеся его структурными переходами из R– в Т-состояние. На уровне капилляров малого круга кровообращения это может быть дополнительным механизмом, способствующим оксигенации крови, а на уровне микроциркуляции большого круга – оптимизирующим десатурацию крови, и, соответственно, доставку кислорода в ткани.

Транспорт углекислого газа кровью

Химические реакции связывания СО2 несколько сложнее, чем О2. Это обусловлено тем, что механизмы, отвечающие за транспорт СО2, должны одновременно обеспечивать поддержание кислотно-щелочного равновесия крови и тем самым – внутренней среды организма.

I. Первый способ связывания СО2 – прежде всего происходит гидратация молекул СО2 с образованием Н2СО3

СО2 + Н2О ® Н2СО3

В плазме эта реакция протекает очень медленно. В эритроцитах она ускоряется в 20 тысяч раз, что связано с действием карбоангидразы – фермента, расположенного только внутри клеток. Его существование предполагал еще И.М.Сеченов, но открыт он был в 1932 г. Мелдрумом и Рафтоном.

Следующая реакция в цепи химических превращений СО2 заключается в диссоциации слабой кислоты Н2СО3 на бикарбонат-ионы и Н+.

Н2СО3 ® НСО3־ + Н+

Накопление НСО3־ в эритроцитах приводит к тому, что между его внутренней средой и плазмой крови создается градиент концентрации этого иона. НСО3 могут передвигаться по этому градиенту лишь в том случае, если при этом не будет нарушаться равновесное распределение электрических зарядов. Т.е., одновременно с выходом НСО־3 должен происходить либо выход из эритроцитов одного катиона, либо вход одного аниона(рис.2.7.). Поскольку мембрана эритроцитов практически непроницаема для катионов, но проницаема для небольших анионов, взамен НСО3 в эритроциты поступает Cl-. Этот обменный процесс называется хлоридным сдвигом Хамбургера.

Участие эритроцитов в обмене О2 и СО2 в тканях и в легких

А- между тканями и кровью; Б- между кровью и альвеолярным воздухом

Накопление анионов внутри эритроцитов приводит к повышению осмотического давления, что вызывает поступление в них воды. В результате этого объем эритроцитов в венозной крови больше, чем в артериальной. Поэтому эритроциты занимают 40% объема артериальной крови и 40,4% – венозной. Образующиеся при реакции диссоциации Н2СО3 протоны не изменяют рН, поскольку гемоглобин, будучи амфолитом, обладает значительной буферной емкостью. Кроме того, восстановленный гемоглобин является более слабой кислотой, чем оксигемоглобин, поэтому может присоединять дополнительное количество Н+. В тканях Hb ведет себя как основание:

KHbO2 ® ­O2 = KHb +H2CO3 ® H Н b H+

  (HСО3 + H+)

II. Второй способ связывания СО2 – непосредственное его присоединение к аминогруппам белкового компонента гемоглобина за счет образования карбаминовой связи. В легких Hb выполняет функцию кислоты:

HbNH2 + CO2 ® HbNHCOO- + H+

Соединение гемоглобина с СО2 называется карбаминогемоглобином. На количество связываемого таким образом СО2 влияет оксигенация гемоглобина. Присоединение О2 к гемоглобину уменьшает количество связываемого в виде карбаминового соединения СО2.

Еще в 1892 г. Вериго было установлено, что газовая емкость по отношению к СО2 крови, содержащей восстановленный гемоглобин, значительно выше, чем в условиях полной оксигенации гемоглобина. Это явление, затем подробно изученное Холденом (1914), обусловлено тем, что, во-первых, оксигемоглобин является более сильной кислотой, чем восстановленный гемоглобин, и, следовательно, когда реакция происходит между КНbO2 и Н2СО3, равновесие наступает при образовании меньшего объема КНСО3, чем в случае, когда реакция течет между КНb и Н2СО3. Во-вторых, оксигенация гемоглобина ведет к снижению образования карбаминогемоглобина, поскольку уменьшает количество свободных NH2 групп глобина, способных связывать СО2. Следовательно, оксигенация гемоглобина влияет на способность крови связывать СО2. Это явление получило название эффекта Вериго-Холдена.

Соотношение между фракциями СО2 в крови. Каждый мл крови, протекая через ткани, захватывает примерно 2 мМоль СО2. 5-10% этого количества остается в физически растворенном виде, 10% образует карбаминовую связь с гемоглобином, 35% транспортируется в виде бикарбонатов в эритроцитах, а остальные 45% – в виде бикарбонатов натрия – в плазме. При прохождении крови через легкие СО2 выделяется из этих фракций точно в таком же соотношении.

Таким образом, дыхательная функция крови является важной составной частью функциональной системы транспорта газов и необходима для следующего этапа дыхания – газообмена между кровью и тканями.