Кровезаменители на основе гемоглобина

Комментарии

Опубликовано в журнале:

Мир Медицины »» №5-6’2000 »» Новая медицинская энциклопедия

Отечественные разработки

Использование цельной крови (часто неоправданное) оказывает на организм больного сложный комплекс воздействий, последствия которых зависят от многих показателей. Один из методов, альтернативных применению аллогенной крови – использование кровезаменителей, обладающих функцией переноса газов крови. О своем опыте применения отечественных растворов кровезаменителей рассказывают директор РНИИ гематологии и трансфузиологии, член-корр. РАМН Евгений Алексеевич Селиванов, руководитель лаборатории перфторуглеродов ВМедА академик РАМН Генрих Александрович Софронов, заместитель зав. кафедрой неотложной хирургии ВМедА, профессор Михаил Дмитриевич Ханевич.

Кровь и ее компоненты по-прежнему остаются опасными биологическими продуктами, способными быть источником гемотрансмиссивных болезней, причиной развития различных посттрансфузионных реакций и осложнений.

Заготовленная на консервирующих растворах кровь в процессе хранения подвергается существенным изменениям. В ней повышается содержание натрия, калия, аммиака, фосфатов и глюкозы, нарушается кислотно-щелочное равновесие,увеличивается сродство гемоглобина к кислороду, изменяются морфофункциональные свойства эритроцитов и происходит частичный их гемолиз, появляются микроагрегаты из клеточных элементов и др.

Период хранения крови, даже при использовании самых современных гемоконсервантов, небольшой. Уже в течение первых 10 суток хранения способность крови к транспорту кислорода существенно уменьшается. Во всем мире наблюдается сокращение числа доноров, что создает проблемы с обеспечением кровью и ее дериватами. Часто кровь и ее компоненты могут быть недоступны, особенно в экстремальных ситуациях. Альтернативой цельной крови могут быть кровезаменители-переносчики кислорода (КЗПК). В настоящее время интенсивно разрабатываются два направления в их создании:

o растворы модифицированного гемоглобина (МГ),

o эмульсии перфторуглеродов (ПФУ). Эти вещества, замещая основную функцию крови – кислородтранспортную, имеют ряд преимуществ:

o универсальны,

o не требуют изосерологического подбора,

o практически безопасны в отношении переноса инфекций,

o имеют длительный срок годности,

o их можно накапливать в больших количествах и применять немедленно.

Малый размер частиц ПФУ и молекул МГ обеспечивает доставку кислорода к клеткам ишемизированных тканей через резко суженные капилляры в условиях нарушенного микрокровотока. Существует несколько областей возможного клинического применения КЗПК:

o при обширных операциях в сердечно-сосудистой хирургии, в травматологии, ортопедии и пр., для уменьшения потребности в аллогенной крови;

o в экстренных ситуациях при восполнении острой кровопотери, когда нет времени и возможности серологического подбора крови или вообще нет доступа к ее запасам;

o в качестве компонента программы лечения апластической и гемолитической анемии;

o при нарушениях микроциркуляции, уменьшающих эффективность трансфузии эритроцитных компонентов;

o при консервировании органов и тканей;

o у пациентов, отказывающихся по религиозным соображениям от переливания крови и ее компонентов.

Препараты на основе МГ

Единственным в мире КЗПК на основе МГ, успешно прошедшим клинические испытания и разрешенным к медицинскому применению (декабрь 1998), является российский препарат “Геленпол” на основе полимеризованного гемоглобина человека. Препарат создан сотрудниками Российского НИИ гематологии и трансфузиологии МЗ РФ и НИИ высокомолекулярных соединений РАН.

С июня 1997 года в клинике неотложной хирургии ВМедА проводится клиническое изучение Геленпола. К настоящему времени препарат использован у 79 больных при лечении геморрагического шока, для коррекции интраоперационной кровопотери, до- и послеоперационной анемии. Геленпол вводили внутривенно, струйно или капельно, в объеме 1-5 доз препарата в до-, послеоперационном периоде, а также во время хирургического вмешательства. У ряда больных подобные инфузии повторяли в течение лечения 4-6 раз. Проводимый мониторинг показал, что Геленпол

o хорошо переносится и не вызывает побочных эффектов,

o обеспечивает нормализацию гемодинамических показателей,

o улучшает работу сердца,

o уменьшает степень анемии,

o увеличивает степень насыщения гемоглобина артериальной и венозной (с 32 до 44 мм рт.ст.) крови О2,

o улучшает микроциркуляцию.

Геленпол

o Молекулярная масса 150-260 кД,

o рО2 равняется 28 торр,

o период полувыведения – 8-14 часов.

o одна лечебная доза кровезаменителя (в лиофильно высушенной форме) содержит 4 г гемоглобина; в качестве стабилизаторов и антиокислителей используются глюкоза и аскорбиновая кислота.

Инфузия Геленпола увеличивала содержание гемоглобина в циркулирующей крови (в среднем, с 68 до 88 г/л) и ретикулоцитов. Применение препарата позволило в 1.5-2 раза уменьшить объем трансфузии крови и эритрокомпонентов.

Перспективными направления дальнейших разработок препаратов на основе МГ являются:

o создание комплексов МГ с ферментами ангиоксидангной защиты (каталазой и супероксиддисмутазой) для предупреждения реперфузионного синдрома;

o моделирование эритроцита – изыскание стабильных форм инкапсулированного гемоглобина, заключенного вместе с компонентами своего естественного микроокружения в липосомы либо в проницаемые для продуктов метаболизма нанокапсулы из биодеградируемого материала.

Препараты на основе ПФУ

В отличие от гемоглобина, ПФУ не образуют химических соединений с кислородом, а растворяют его и другие газы согласно закону Генри. Эта связь – линейная, и степень растворения кислорода в ПФУ прямо пропорциональна его парциальному давлению (в отличие от сигмоидной кривой диссоциации оксигемоглобина).

История изучения ПФУ, как основы КЗПК, ведет свое начало от экспериментов Clark и Gollan. В 1960-х годах эти ученые показали возможность поддержания жизни мышей в жидкой перфторорганической среде, насыщенной кислородом.

ПФУ не метаболизируются в организме и считаются биологически инертными. Частицы внутривенно введенной эмульсии ПФУ быстро (в течение 4-12 часов) удаляются из сосудистого русла ретикуло-эндотелиальной системой, накапливаются в легких и селезенке с последующей экскрецией через дыхательные пути. Инфузии ПФУ в условиях кровопотери и гиповолемии:

o обеспечивают ткани кислородом,

o оказывают положительный эффект на центральную и периферическую гемодинамику, микроциркуляцию, кислотно-щелочное состояние, иммунную систему,

o обладают дезинтоксикационным, противовоспалительным свойствами и мембраностабилизирующим действием.

В нашей стране исследования по созданию КЗПК на основе эмульсий ПФУ проводились с 1970-х годов в Ленинградском и Центральном НИИ гематологии и переливания крови, Институте теоретической и экспериментальной биофизики (ИТЭБ) АН СССР. К 1984 году в ИТЭБ был создан, а затем усовершенствован первый отечественный препарат, получивший название “Перфторан”. В феврале 1996 года эмульсия Перфторан (фирма “Перфторан”) зарегистрирована в РФ и разрешена для медицинского применения и промышленного выпуска.

Перфторан широко используется в различных областях клинической практики. Был апробирован в военной медицине при лечении боевой травмы.

Наш опыт применения Перфторана для восполнения кровопотери (внутривенное введение на фоне ингаляции смеси, обогащенной кислородом) показывает, что препарат:

o обеспечивает нормализацию гемодинамических показателей,

o улучшает работу сердца,

o увеличивает напряжение кислорода в смешанной венозной крови, что можно рассматривать как признак уменьшения гипоксии тканей (значения рvO2,не превышали физиологической нормы – 40-45 мм рт.ст., – при которой осуществляется полноценный газообмен между эритроцитами и тканями),

o улучшает микроциркуляцию и реологические свойства крови;

o улучшает состояние антиоксидантной

системы крови.

Использование Перфторана уменьшает расход донорской крови и ее компонентов в 1.5-2 раза.

Сравнительный анализ препаратов

Наш опыт применения в условиях одной клиники различных КЗПК – раствора полигемоглобина (Геленпол) и эмульсии ПФУ (Перфторан) позволяет сравнить возможность и эффективность их применения.

Перфторан чаще использовали по неотложным показаниям (72.8%), а Геленпол – в плановом порядке (58.3%). Это связано, в первую очередь, с тем, что препарат искусственного гемоглобина способен стимулировать гемопоэз и таким образом эффективен при лечении больных с хроническими анемиями и при подготовке больных к операции. В то же время Перфторан начинали вводить во время оперативного вмешательства после устранения источника кровотечения и убежденности в надежности гемостаза. Это касалось как экстренных, так и плановых оперативных вмешательств. Чаще всего возникала необходимость в инфузиях Перфторана и Геленпола при острой кровопотере, сопровождавшейся геморрагическим шоком. В таких случаях Перфторан был перелит 32.1 % больных, а Геленпол – 31.2%. Нередким показанием к применению КЗПК явилась интраоперационная кровопотеря. В ряде случаев препараты оказались эффективными для предупреждения декомпенсации функции жизненно важных органов и систем организма (например, при наличии постинфарктного кардиосклероза, хронических неспецифических заболеваниях легких, диффузных поражениях печени, а также при патологических изменениях мочевыделительной системы).

Имеющиеся у нас данные позволяют дифференцировать Перфторан и Геленпол по влиянию на функции различных систем организма (таблица). Установлено выраженное воздействие Перфторана на газотранспортную функцию крови, ее реологические свойства и микроциркуляцию. Отмечена достаточно высокая эффективность его влияния на гемодинамику, иммунологическую реактивность организма, процессы перекисного окисления липидов. В то же время Перфторан был нейтрален в отношении гемопоэза и свертывающей системы крови, мало участвовал в нормализации кислотно-основного состояния крови. Геленпол наибольший эффект оказывал на гемодинамику, усиливал гемопоэз и газотранспортную функцию крови. Однако Геленпол не влиял на иммунную реактивность организма, КОС крови, ее реологические свойства и микроциркуляцию.

Таблица. Сопоставление эффектов геленпола и перфторана

ПОКАЗАТЕЛИ	ПЕРФТОРАН	ГЕЛЕНПОЛ
Газотранспортная функция	+++	++
Гемодинамический эффект	++	+++
Гемопоэз	–	++
Кислотно-основное состояние крови	+	–
Иммунологическая реактивность организма	++	–
Процессы перекисного окисления липидов	++	+
Микроциркуляция и реологические свойства крови	+++	–
Свертывающая система крови	–	+

+++ – сильный эффект, ++ – средний эффект, + – слабый эффект, – – отсутствие эффекта

Клинические наблюдения, данные экспериментальных исследований и анализ литературы позволяют предполагать следующие механизмы лечебного действия КЗПК.

Геленпол:

o моделирует дыхательную функции эритроцитов и функции плазменных белков;

o повышает содержание гемоглобина в циркулирующей крови и его синтез;

o усиливает транспорт оксида азота (N0) и S-нитрозотиолов (SNO),

Перфторан:

o пассивный переносчик кислорода и углекислого газа пропорционально перепаду парциального давления соответствующего газа;

o усилитель потока кислорода и углекислого газа за счет увеличения их массопереноса, обусловленного повышенной растворимостью газов в ПФУ и возможностью свободного прохождения газов через частицы;

o демпфер (за счет образования дополнительной емкости для газов крови в плазме), создающий подпор для кислорода при его потреблении.

Препараты имеют как общие свойства, так и различия в действии, поэтому могут применяться раздельно и вместе, дополняя лечебный эффект друг друга. В условиях контролируемой интраоперационной кровопотери и возможности ведения пациента на смеси, обогащенной кислородом, эмульсии ПФУ, очевидно, предпочтительнее растворов МГ. В то же время для коррекции анемии в дооперационном и послеоперационном периодах целесообразно использовать Геленпол. Состояние исследований по проблеме создания КЗПК на основе МГ и эмульсий ПФУ создает уверенность в том, что эти инфузионные среды, моделирующие самую главную, кислородтранспортную функцию крови, уже в начале XXI века займут достойное место в различных программах, альтернативных применению донорской крови.

Попытки применения растворов гемоглобина в клинических целях предпринимались уже в начале века и были возобновлены в 30 – 40 гг. Эксперименты по введению растворов гемоглобина в различных дозах, концентрациях и при разных степенях кровопотери показали способность последних поддерживать жизнь животных, обеспечивая транспорт кислорода. Однако эти работы выявили также выраженную нефротоксичность этих препаратов.

Одна из основных причин нефротоксичности установлена в 1967 г. после применения растворов гемоглобина, очищенных от стромальных компонентов. Они не повреждали почки. Сделан вывод в том же году, что повреждение почек вызывается стромальной фракцией эритроцитов [52].

Выше уже говорилось о том, что раствор гемоглобина при введении его в кровоток резко увеличивает онкотическое давление, тем самым изменяя гемодинамику. Однако, согласно последним данным, полимеризованный гемоглобин с молекулярной массой 600 000 при концентрации 6г/100 мл обнаруживает сравнительно небольшое онкотическое давление крови порядка 20 мм. рт. ст., что близко к онкотическому давлению крови. Но при концентрации 12г/100мл раствор такого гемоглобина имел онкотическое давление 40 мм. рт. ст. Но в Америке (A.G. Greenburg) создан гемоглобин с молекулярной массой 1млн., который даже в концентрации 14г/100 мл обусловливал онкотическое давление 20 мм рт. ст. При такой концентрации раствор имеет кислородную емкость, равную таковой для цельной крови.

В современной литературе по этой проблеме встречаются мнения о том, что полимеризованный гемоглобин с большой и очень большой молекулярной массой является первым реальным кандидатом на преклинические и клинические испытания. Но возникают проблемы, без решения которых нельзя приступать к клиническим испытаниям.

Одна из таких проблем – неясность судьбы этих гигантских молекул в организме.

Предполагают, что они разрушаются в ретикулоэндотелиальной системе опсонинами плазмы и макрофагами. Внеэритроцитарный гемоглобин слишком быстро выводится из кровеносного русла [53].

В настоящее время обсуждаются следующие пути решения этой проблемы: моделирование эритроцитов путем микрокапсулирования растворов гемоглобина; химическая модификация гемоглобина с получением полигемоглобина и его конъюгатов с биополимерами; внутримолекулярная модификация гемоглобина, препятствующая его диссоциации на димеры.

Важным направлением в современном развитии проблемы создания “искусственной крови” является создание неких микротелец или микрокапсул, содержащих гемоглобин. Но первые опыты были неудачны, а перспективную идею вывели из небытия совсем недавно M.C. Farmer и B.P. Garber, создав методику получения липосом. При осуществлении микрокапсулирования растворов гемоглобина для создания искусственных мембран используются, кроме липидов, и синтетические полимеры, некоторые полимеризованные белки. Толщина получаемых мембран сравнима с толщиной мембран эритроцитов.

Казалось бы, что эта упрощенная модель эритроцита, судя по экспериментальным данным, может успешно функционировать в человеческом организме, и пора бы переходить на клинические испытания. Но в этих липосомах гемолипидный комплекс был способен осуществить лишь около 1 тысячи циклов “оксигенация – дезоксигенация”. Это означает 6 – 8 часов “работы”. Эритроцитарный же гемоглобин функционирует в течение 90 – 120 дней (по другим данным 40 дней) и способен осуществить 400 тысяч циклов.

Кроме этого, автор в своей работе засекретил методику изготовления микротелец, но, учитывая строение микротелец и насколько сложна их конструкция, можно предположить, что методика очень дорогая и трудоемкая, и она не сможет удовлетворить потребности, например при массовом травматизме. К тому же возникает вопрос о механизмах разрушения и дезактивации таких очень сложных структур и продуктов их разрушения. Отмечается также внедрение искусственных липосом в элементы ретикулоэндотелиальной системы клетки и нарушении ее функции [52, 53, 54].

Самой важной проблемой создания “искусственной крови” данного направления остается сохранение гемоглобином нативных свойств в течение длительного промежутка времени. В норме непрерывно происходящее разрушение этой сложной молекулы в эритроците купируется с помощью биологической работы ресинтеза, которая протекает с использованием энергии за счет гидролиза АТФ. Возможность искусственного получения таких мембран была показана еще 20 лет назад. Имеется принципиальная возможность создания таких мембран и для гемоглобинсодержащих липосом, но такая перспектива выглядит довольно отдаленной [53, 51].

Недостаток модифицированного гемоглобина – в более высоком, по сравнению с донорской кровью, сродстве к кислороду, что связано с отсутствием регулятора обратной оксигенации и более низкой кислородной емкости. В последнее время найден метод, который позволяет устранить этот недостаток путем создания модифицированного гемоглобина, способного к обратимой оксигенации. Вследствие больших размеров молекулы модифицированного гемоглобина (при его степени полимеризации свыше 25 – 30%) увеличивается СОЭ до 55 – 60мм/ч [55].

В последнее время активизировались исследования бычьего гемоглобина с целью использования его в качестве основы для создания “искусственной крови”. Бычий гемоглобин тщательно очищают от примесей путем кристаллизации, полимеризуют и соединяют его с пиридоксаль-фосфатом.

Перфторуглеродные эмульсии.

Другое направление создания “искусственной крови” – создание синтетической модели крови на основе перфторорганических соединений.

Уникальные свойства ПФУ – способность растворять кислород и углекислоту, высокая инертность – послужили основанием для создания кислородпереносящих кровезаменителей именно на основе перфторуглеродов. Первое поколение ПФУ – флюосол- ДА (Япония) был испытан в клинике [56].

Перфторированные жидкости полностью нерастворимы в воде и поэтому в качестве кровозаменителей их можно использовать только в виде эмульсий. Капельки эмульсии можно рассматривать как своеобразную модель эритроцита, где фторуглерод заменяет гемоглобин, а слой эмульгатора наружную мембрану эритроцита. Но, в отличие от гемоглобина, характер присоединения и отдачи кислорода эмульсией перфторуглеродистых соединений иной. Кривая диссоциации цельной крови (оксигемоглобин) имеет S-образную форму, зависимость насыщения же фторорганической эмульсии от парциального давления кислорода выражается на графике прямой линией [49]. Известны ПФУ, обладающие повышенной кислородной емкостью: диметиадамантан, октилбромид и некоторые другие [53, 57].

В рецептуру большинства существующих в настоящее время эмульсий перфторорганических соединений, предназначенных для применения в медицинской практике, включен синтетический эмульгатор, относящийся к классу поверхностноактивных веществ – блоксополимер оксида этиленаоксида пропилена, известный в зарубежной литературе под названием “плюроник”, а в отечественной – “проксанол”.

Это поверхностно-активное вещество стабилизирует перфторорганические соединения in vitro, препятствуя процессу коалесценции [58].

Эмульсии перфторорганических соединений могут быть использованы для трансфузии, по мнению некоторых исследователей, только лишь в том случае, если животные или человек будут дышать при этом не воздухом, а кислородом [49,59].

Известно, что различные эмульсии перфторорганических соединений неодинаково выводятся из организма, некоторые из них могут длительное время сохраняться в организмах экспериментальных животных. Это представляет серьезную проблему, решить которую позволят исследования длительности нахождения фторуглеродов в организме, времени циркуляции в кровотоке, мест кумуляции и депонирования, методов дезинтоксикации и путей выведения из организма. Кроме того, частицы эмульсии перфторорганических соединений способны сорбировать большие количества холестерина и липидов, что, возможно, влияет на время циркуляции в кровотоке и места кумуляции. Этот эффект сорбции можно использовать в медицинской практике, в частности в кардиологии. Эффект нужно учитывать при разработке новых эмульсий ПФУ и иметь ввиду при назначении таких препаратов больным с большим содержанием холестерина в крови. У эмульсий ПФУ есть еще один эффект, который нельзя не учитывать: применение их в качестве кислородпереносящих кровезаменителей активирует в клетке функции цитохрома Р 450. Такой эффект указывает на повышенное образование в клетке кислородных радикалов, которые могут участвовать в разрушении клеточных структур. Эмульсии ПФУ не влияют на реакцию связывания аллоантигенов человека с полными (АВО) и неполными (Rh), алло- и преципитирующими ксеногенными антителами и, следовательно, на определение групповой и резуспринадлежности крови. Присутствие эмульсии ПФУ заметно угнетает реакцию лимфоцитотоксических HLA – антител с лимфоцитами, розеткообразование Т- и В-лимфоцитов. Эмульсии ПФУ обеспечивают эффективное восстановление капиллярного кровотока, функционального состояния микрососудов и перфузии тканей.

Одним из недостатков инфузии кровезамещающего раствора является некоторое ухудшение агрегатного состояния крови и повышение проницаемости микрососудов. Вполне вероятно, что эти качества препарата связаны с недостаточной очисткой исходного материала и неполной гомогенностью суспензии [58, 53, 60, 61, 62, 63].

Плазмозаменяющие препараты.

В настоящее время разработана рациональная классификация кровезаменителей (О.К. Гаврилов, П.С. Васильев, 1975). В ее основу положены их функциональные свойства и особенности действия. Исходя из того, что показаниями к переливанию крови являются:

1) кровопотеря и шок различного происхождения;

2) интоксикации;

3) дефицит белка, были предложены препараты, позволяющие заменить хотя бы одну из этих функций крови.

С учетом того, что инфузионные средства осуществляют коррекцию патологических изменений в крови больного, возникающих в организме при различных патологических состояниях, их еще можно называть гемокорректорами (О.К. Гаврилов, 1975). В соответствии с указанными выше лечебными функциями гемотрансфузий выделяются следующие основные группы кровезаменителей.

К первой группе относятся полиглюкин, реополиглюкин, желатиноль, полифер. Их назначают для лечения кровопотери, шоков различного генеза, при операциях для восстановления гемодинамики и микроциркуляции, а также для гемодилюции.

Вторая группа кровезаменителей включает дезинтоксикационные инфузионные жидкости (гемодез, полидез, неогемодез). Эти препараты применяются для лечения заболеваний, которые сопровождаются интоксикациями: отравлений, ожогов, лучевой болезни, лейкозов, токсической диспепсии, дизентерии, гемолитической болезни новорожденных, а также болезней печени и почек.

К третьей группе относятся препараты, применяемые для парентерального питания. Это белковые гидролизаты (гидролизат казеина, аминопептид, аминокровин, гидролизин и др.), смеси аминокислот (аминон, вамин, полиамин, мориамин, морипрон, азонутрил, альвезин и др.), жировые эмульсии (липофундин, интралипид и др.), витаминные смеси для парентерального введения (солувит).

Выделяют также и четвертую группу кровезаменителей, к которой относят кристаллоидные солевые растворы: дисоль, трисоль, хлосоль и др., а также осмодиуретические вещества. Эти средства участвуют в регуляции кислотно-основного равновесия, водно-электролитного обмена и отчасти корригируют состав крови.

В настоящее время активно ведутся работы, направленные на создание кровезаменителей, которые могут быть отнесены к пятой группе – переносчики кислорода.

И, наконец, выделяют шестую группу – кровезаменители комплексного действия.

Независимо от группы и характера действия, все кровезаменители должны обладать физико-химическими и биологическими свойствами, близкими свойствам плазмы крови, т.е. должны быть: изоионичными; изотоничными; изоосмолярными; неанафилактогенными.

Рекомендуемые страницы: