Методы исследования гемоглобина гемоглобинцианидным методом
20 февраля 2019 г.
Гемоглобин (Hb) – пигмент крови, который вместе с эритроцитами переносит кислород воздуха от альвеол легких к органам-мишеням. Без этого действия невозможна жизнедеятельность человека. Существуют различные состояния и заболевания, при которых показатель снижается. Поэтому в лабораториях используют различные методы для его выявления. Одним из них является гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина. Он имеет положительные и отрицательные стороны, которые учитывает врач перед назначением исследования.
Суть гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина
Гемоглобин имеет множество различных форм. Все их пересчитать невозможно. Поэтому используют гемиглобинцианидный метод, который дает возможность определить одну форму – гемиглобинцианид (HbCN). Клетки трансформируется, так как на них воздействуют реактивы:
- феррицианид калия – переводит гемоглобин в метгемоглобин;
- цианид калия – образует гемиглобинцианид, который имеет красное окрашивание;
- дигидрофосфат калия – вещество, с помощью которого реакция ускоряется
- не ионный детергент – разрушает эритроциты, исключает помутнение раствора, вызванное выделением белков.
Если в лаборатории нет феррицианида калия, гемиглобинцианидный метод проводят с применением ацетонциангидрита, который также образует метгемоглобин. На его основе создан набор реагентов – гемоглобин-АГАТ. Гемиглобинцианидный метод с калибратором рассчитан на 600 определений при расходе 5 л рабочего раствора за 1 анализ. Стоимость такого набора не высока, поэтому часто он применяется в клинической лабораторной диагностике.
Методика одобрена Комитетом стандартизации. Поэтому исследование является унифицированным, то есть общепринятым во всех лабораториях. Для анализа необходимо получение капиллярной и венозной крови. В последнем случае результат будет более достоверным. В полученную биологическую жидкость добавляют антикоагулянт, который предотвращает образование сгустков.
Далее ход проведения исследования делится на несколько этапов.
- Проводят разведение в соотношении 20 микролитров крови на 5 мл реактива. Полученную жидкость перемешивают. Возможно использование центрифуги. Пробирку отстаивают в течение 10 минут.
- Для исследования жидкости используют фотометр. Он определяет клетки на длине волны 543 нм. В этих пределах измеряется гемиглобинцианид.
- Дополнительно в прибор устанавливают стандартный раствор, с которым сравнивается полученный результат. Это необходимо для калибровки величины.
- Полученные данные подставлять в калибровочный график. Для упрощения можно определять концентрацию гемоглобина гемиглобинцианидным методом без калибра. В этом случае используют формулу.
Формула для определения количества гемоглобина:
Hb= Eопт/Eст×C×K×0,001×10
- Eопт – экстинкция (проницаемость) опытного образца;
- Eст – экстинкция стандартного образца;
- С – количество гемиглобинцианида в стандартном образце;
- К – коэффициент разведения биологической жидкости;
- 0,001 – число, необходимое для пересчета миллиграммов в граммы;
- 10 – число для пересчета г% в г/л.
После получения данных возможно их сравнение с нормой. Это может осуществлять пациент, но для постановки точного диагноза и проведения лечения необходимо проконсультироваться с лечащим врачом.
Незначительное отклонение показателя от нормы не говорит о наличии какого-либо заболевания. В этом случае проводят повторное тестирование. Если показатель отклоняется на несколько единицы в нижнюю или верхнюю сторону, врач должен провести дополнительные тестирования, назначить лечение.
Данные по нормальному количеству гемоглобина в исследуемой жидкости записаны в таблице. Число показателя меняется с возрастом, зависит от пола.
Возраст | Женский пол, г/дл | Мужской пол, г/дл |
1-3 года | 10,5-12,8 | 10,2-12,6 |
3-6 лет | 10,5-12,9 | 10,3-12,8 |
7-13 лет | 10,5-13 4 | 10,8-13,2 |
От 13 лет и выше | 11,5-15,7 | 14,8-17,4 |
Плюсы гемиглобинцианидного метода измерения гемоглобина
Исследование с помощью добавления цианида к крови имеет множество положительных сторон:
- исследование унифицировано, то есть считается достоверным, одобрено Комитетом здравоохранения;
- методика позволяет перевести все формы гемоглобина в одну, которую возможно рассчитать с помощью фотоколориметра;
- полученный гемиглобинцианид имеет длину волны 540 м, которую улавливает полуавтоматический оптический прибор для определения показателя;
- использование дешевых реактивов, которые не приносят клиническому учреждению больших финансовых затрат;
- простата методики, которую может выполнить любой врач лаборант;
- большой срок годности реактивов;
- применение незначительного количества реактива для 1 исследования, что позволяет проводить множество анализов за 1 сутки;
- быстрота проведения анализа, которая переводит его в экспресс-метод;
- применение полуавтоматического анализатора, самостоятельно подсчитывающего данные, что снижает риск получения врачебной ошибки.
Минусы гемиглобинцианидного метода определения гемоглобина
Использование цианидных реактивов в лабораторной диагностике устарела. Это вызвано тем, что исследование имеет следующие отрицательные стороны:
- возможность поражения кожных покровов и дыхательных путей врача-лаборанта реактивами;
- наличие более современных методов, которые более безопасны для лаборанта;
- возможность врачебной ошибки в неправильной подборке дозировки реактивов;
- прибор не выдает данные по определению формы или размеров клеток, поэтому для их выявления требуется проведение дополнительных анализов.
Так как цианидные соединения являются вредными для человека, разработан гемихромнй метод. Он полностью безопасен и на данный момент вытесняет гемиглобинцианидную методику из клинической лабораторной диагностики.
Показания к применению гемиглобинцианидного метода
Для проведения методики необходимые показания я ее проведению.
- Плановая диспансеризация пациента, проверка состояния его здоровья. Определение гемоглобина является одним из наиболее частых методик в лабораторной диагностике, так как показатель влияет на состояние множества тканей и органов.
- Наличие заболевания красного костного мозга, которое приводит к снижению количества эритроцитов или сразу всех ростков кроветворения.
- Чрезмерная продукция эритроцитов в красном костном мозге, которая приводит к эритроцитемии. Повышение количества Hb до критических значений не является положительной стороной, состояние требует лечебных мероприятий.
- Подозрение на анемию.
- Определение показателей во время проведения лечебных мероприятий. После получения данных врач может скорректировать дозировку препаратов или заменить их.
Возможные ошибки в применении гемиглобинцианидного метода
Исследование крови с помощью методики может быть неточной. Это вызвано тем, что возможны различные ошибки в ее проведении:
- нарушения в подготовке пациента к исследованию (отсутствие диеты, использование активных физических нагрузок, употребление некоторых категорий лекарств);
- нарушение правил забора крови (резкое изменение положения тела пациента в пространстве, работа кулаком при взятии венозной крови, использование не стерильных инструментов и пробирок);
- отсутствие добавления антикоагулянта, что приводит к образованию сгустка и делает невозможным проведение исследования;
- чрезмерно долгое стояние пробы без проведения исследования;
- неправильная дозировка реактивов, вышедший срок годности химических веществ, неправильно подобранная концентрация жидкости для разведения, отсутствие перемешивания крови после добавления реактива, осуществление исследования без настаивания полученной жидкости после добавления химических веществ;
- ошибка в расчете формулы;
- использование загрязненных приборов или фотоколориметра, что делает проведение исследования невозможным, так как прибор не может рассчитать длину волны.
Для исключения получения неточных данных врач должен назначить несколько исследований. Если оба показателя примерно одинаковы, это говорит о достоверности. Перед назначением анализа врач должен предупредить о подготовительных мероприятиях, которым должен в точности руководствоваться пациент. Это связано с тем, что уровень показателя зависит от состояния организма и воздействующих на него факторов.
Гемиглобинцианидный метод – точная методика, которая использовалась в лабораториях раннее. На данный момент она заменена другими исследованиями, так как применение цианидных компонентов может нанести вред здоровью врача-лаборанта. Несмотря на это, анализ считается наиболее точным и достоверным, поэтому он был унифицирован Комитетом здравоохранения. Методика проста в использовании, реактивы недорогие, анализы проводятся быстро.
Современным и точным методом измерения гемоглобина сегодня является гемихромный метод. Возможно, Вам будет интересно почитать обзор всех методов определения гемоглобина в крови.
Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro
Полезное видео
Подсчет тромбоцитов по Фонио – точен ли метод?
Общее число нейтрофилов: о чем говорит показатель?
Откуда лучше брать общий анализ крови – пальца или вены?
Домашние анализаторы крови: преимущества и недостатки
Принцип этого метода заключается в том, что после взаимодействия с трансформирующим раствором, содержащим ацетонциангидрин, гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), который под влиянием CN-ионов образует окрашенный в красный цвет комплекс — цианметгемоглобин (ге-миглобинцианид). Оптическую плотность раствора определяют на универсальном или специальном фотоэлектроколориметре (гемоглобинометре).
Оснащение
1.Гемоглобинометр фотоэлектрический типа ГЭ-3.
2.Трансформирующий раствор с ацетонциангидрином.
3.Пипетка объемом 0,02 мл.
4.Пипетка объемом 5 мл.
5.Пробирка.
Техника выполнения
1.0,02 мл крови приливают в 5 мл трансформирующего раствора в пробирки (разведение 1:250) и хорошо перемешивают.
2.Через 10 минут (раствор остается стабильным в течение более 24 часов) измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против холостой пробы трансформирующего раствора или на гемоглобинометре.
3.Концентрацию гемоглобина в «г/л» определяют по калибровочному графику, построенному с использованием стандарта гемиглобинцианида.
Источник ошибок
Отклонения получаемых значений могут быть связаны только с погрешностями взятия крови или с неисправностью фотометрической аппаратуры.
Опенка результатов
В норме концентрация гемоглобина в крови составляет: у женщин 120 -145 г/л, у мужчин- 130 – 165 г/л. Снижение концентрации гемоглобина обычно сочетается с эритропенией, а повышение – с эритроцитозом.
Концентрация гемоглобина после рождения составляет 210 г/л (180-240 г/л). Дальнейшая динамика этого показателя соответствует изменениям, наблюдающимся со стороны концентрации эритроцитов.
Определение цветового показателя и среднего содержания гемоглобина в эритроците.
Расчетные показатели, характеризующие состояние красной крови
Исходя из данных концентрации эритроцитов и гемоглобина, можно оценить степень насыщения эритроцитов гемоглобином. В настоящее время во всех странах принято рассчитывать среднее содержание гемоглобина в эритроците, но нередко пользуются и цветовым (цветным) показателем. Информативность этих двух параметров совпадает.
1. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) ССГЭ получают, разделив содержание гемоглобина в 1 литре крови на концентрацию эритроцитов в том же объеме крови:
рад
ССГЭ = (пикограммы, пг), где
[Э]
[НЬ] – концентрация гемоглобина в 1л крови (г/л) [Э] – концентрация эритроцитов в 1 л крови (Т/л)
2.Цветовой (цветной) показатель (ЦП)
ЦП является относительным показателем, характеризующим степень насыщения эритроцитов гемоглобином. Вычисляется путем деления полученного ССГЭ на условно нормальное ССГЭ (166,7 г/л : 5 Т/л = 33,3 пг) или непосредственно, исходя из данных концентрации гемоглобина и эритроцитов, по формуле:
Г*3
ЦП =—— (усл. ед), где
Э*100
Г – концентрация гемоглобина в исследуемой крови (г/л); Э – концентрация эритроцитов в исследуемой крови (Т/л).
Оценка результатов
В норме ССГЭ составляет 28-34 пг, ЦП – 0,85-1,05. На величинах ССГЭ и ЦП основана классическая классификация анемий. Так, при ССГЭ < 28 пг или ЦП <0,85 говорят о гипохромной анемии и гипохромии (гипохромазии) эритроцитов, которая связана с истинным снижением содержания гемоглобина в эритроците или с уменьшением его объема. Если ССГЭ >34 пг или ЦП >1,05, то такая анемия носит название гиперхромной. Гипер-хромия (гиперхромазия) эритроцитов обусловлена исключительно увеличением объема эритроцитов, а не повышением концентрации гемоглобина в единице объема клетки. ССГЭ и ЦП не имеют существенной возрастной динамики у здоровых детей.
Определение СОЭ
Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) СОЭ – скорость оседания эритроцитов, измеряемая при отстаиваниистабилизированной крови в стандартных условиях и зависящая от изменений
химических и физических свойств крови.
Оснащение
1. Аппарат Панченкова (рис. 13), состоящий из специального штатива с гнездами и резиновыми прокладками и специальных капилляров. Капилляры представляют собой стеклянные трубки стандартной длины с просветом канала около 1 мм. На стенку капилляра нанесена миллиметровая (!) шкала длиной 100 мм. Верхние деление шкалы отмечено цифрой «0» и буквой «К» (кровь).
2. 2.5%-ный раствор цитрата натрия трехзамещенного.
3. Часовое стекло или предметное стекло с лункой.
Техника выполнения
1.В капилляр набирают 5%-ный раствор цитрата натрия до метки «75» и выдувают на часовое стекло.
2.Затем к раствору антикоагулянта добавляют кровь, набираемую в капилляр до метки «0» («К»), перемешивают.
3.Капилляр заполняют полученной смесью до метки «О» («К») и фиксируют в штативе.
4.Через 1 час производят учет СОЭ, определяя, сколько делений шкалы (в мм) занимает слой плазмы, очистившийся в результате оседания эритроцитов.
Оценка результатов
В норме СОЭ составляет у женщин 2-15 мм/ч, у мужчин – 1-10 мм/час. Величина СОЭ зависит от концентрации эритроцитов (увеличивается при эритропении, уменьшается при эритроцитозе), вязкости крови (понижается при сгущении крови), соотношения различных фракций белков крови (увеличивается при повышении концентрации бета- и гамма-глобулинов, фибриногена). СОЭ увеличивается при беременности (в связи с повышением концентраций фибриногена).
У новорожденных наблюдается замедление СОЭ, обусловленное эритроцитозом и низкой концентрацией фибриногена. В дальнейшем значение СОЭ соответствует уровню взрослых.
26 февраля 2019 г.
Гемоглобин (Hb) – молекула, с помощью которой переносится кислород. Она расположена внутри зрелых эритроцитов, лишенных ядер. Клетки получают кислород из альвеол легких, переносят его органам к клеткам-мишеням. От них получают углекислый газ, и переносят его обратно в легочную систему. Без этого действия невозможна жизнь человека. Существуют различные состояния, при которых гемоглобин может повышаться или снижаться. Для диагностики используют различные лабораторные методы определения функции соединения гемоглобина. Их подбирает врач индивидуально для каждого пациента.
Клиническое значение определения гемоглобина
У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:
- женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
- мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.
Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.
Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
- недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B12);
- заболевание красного костного мозга.
Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
- компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
- снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.
Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.
Методы измерения гемоглобина в крови
Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:
- гемиглобинцианидный;
- гемихромный;
- Сали;
- аммиачный;
После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.
Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.
Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.
Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи
Унифицированные методы определения гемоглобина
Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.
Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.
Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови
У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.
Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.
Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).
Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.
Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!
Гемихромный метод определения гемоглобина в крови
С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).
Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.
Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.
Цианидный метод исследования гемоглобина в крови
Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.
В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.
Метод Сали для определения гемоглобина в крови
Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.
Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).
На нижнем мениске пробирки будет стоять цифра, которая указывает на содержание показателя в 100 г крови. Для вычисления концентрации в 1 литре, показатели умножают на 10. Процентное содержание Hb вычисляется с помощью пропорции:
16,7%=100
- А%=Х
- Х=А×100/16,7
- Х – определяемый показатель,
- А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
- 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.
Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина
Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:
- Оксигемоглобин;
- Дезоксигемоглобин;
- Карбоксигемоглобин;
- Метгемоглобин.
Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.
Аммиачный метод определения гемоглобина
Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.
Методы определения гемоглобина в моче
Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.
- Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
- Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
- Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
- Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.
Какой метод определения гемоглобина наиболее точный?
Наиболее точным методом определения показателя считается фотоколориметрический с использованием гемихромного разведения. С помощью него снижается риск врачебной ошибки. Прибор автоматически подсчитывает показатель. Здесь важно правильно подготовить приборы, пробирки, кюветы, настроить аппарат. Методика безопасна для лаборанта.
В определении Hb в моче наиболее информативным является использование тест-полосок. Здесь полностью исключается риск неправильного разведения реактивов.
Определение гемоглобина является важным информативным тестом. Можно определить кровотечение в мочевыводящих путях, состояние сердечно-сосудистой и легочной системы. С помощью методов вовремя выявляются различные виды анемии при низких концентрациях гемоглобина. После получения данных рекомендуется обратиться к лечащему врачу. Он расшифрует полученный результат, выявит нормы и отклонения, назначит лечение.
Узнай о методах определения гликозилированного гемоглобина в крови!
Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro
Полезное видео
Подсчет лимфоцитов: разновидности метода
Подсчет количества тромбоцитов в крови – подробно о методиках
Откуда лучше брать общий анализ крови – пальца или вены?
Подсчет количества эритроцитов: выбор лучшей методики