Методы исследования гемоглобина в крови
Общеклинический анализ крови – это первоочередное исследование, назначаемое больным при поступлении в муниципальные или частные клиники. Любые патологические изменения со стороны различных органов отражаются на составе крови.
Общеклинический анализ исследует количественные и качественные свойства красных форменных элементов и содержание в них белка гемоглобина. Квантитативное (количественное) определение гемоглобина в крови – важная составляющая работы лабораторных сотрудников, направленная на своевременное выявление анемии.
Красные форменные клетки вырабатываются (с помощью животных белков, железа и витаминов) в красном костном мозге и разрушаются под действием ферментов селезенки. Они выполняют жизненно важные функции – транспорт кислорода к тканям и утилизацию оксидов углерода. Повышенный или пониженный гемоглобин указывает на патологии органов различной этиологии. В предложенном ниже видео показан процесс переноса оксидов.
Строение и физиология гемоглобина
Гемоглобин – это четвертичная глобула, которая занимается утилизацией и поставкой оксидов в организме человека. Данное пептидное соединение является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц. Одна полипептидная структура способна переносить через кровоток до четырех молекул кислорода.
Гемоглобин состоит из простетической группы и глобулина. Простетическую группу железосодержащего пептида принято называть «гемом». Благодаря гему кровь приобретает свойственный ей окрас – алый или синевато-красный. Простетическая группа содержит железо, которое участвует в восстановительно-окислительных процессах.
Различают несколько основных видов гемоглобина:
- Оксигемоглобин,
- Карбоксигемоглобин,
- Дезоксигемоглобин,
Оксигемоглобин образуется при присоединении кислорода к гемоглобину в условиях высокого парциального давления. При отщеплении кислорода от железосодержащего белка образуется устойчивая форма – дезоксигемоглобин. Карбоксигемоглобин появляется в результате присоединения монооксида или диоксида углерода. Стоит отметить, что монооксид углерода в 250 раз эффективнее связывается с железосодержащим белком, чем обуславливается его опасность для жизни при вдыхании (угарный газ).
Дезоксигемоглобин сильно токсичен для тканей человеческого организма, поэтому существуют специальные системы «ликвидации» гемоглобина в крови. Этим занимается особое пептидное соединение – гаптоглобин.
Определение количества гемоглобина по методу Сали
Метод базируется на свойстве железосодержащего белка превращаться в хлорид гематита под действием соляной кислоты. Методика Сали считается неинвазивным вмешательством.
Интенсивность цвета жидкости прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в крови. Раствор хлоргемина при проведении исследования разводят дистиллированной водой до стандартного цветового спектра.
Важно! Стоит отметить, что гемоглобин по Сали не получил широкого распространения на территории РФ.
Метод, который применяется для определения уровня гемоглобина, принято называть «гемометром Сали». Другое название современного метода определения гемоглобина по Сали – гемоглобинометрия. Такой колориметрический аппарат состоит из специального штатива, который имеет три гнезда.
Боковые гнезда держат две склянки с веществами. Среднее гнездо данного прибора необходимо для размещения пронумерованной мензурки из стекла. Градуированная мензурка обладает шкалой с делениями, которые измеряют количество железосодержащего пептидного соединения в граммах на децилитр (г/дл). При клиническом исследовании крови используется специальная пипетка для воды и размешивания содержимого склянки.
При проведении полного анализа по методу Сали вначале в склянку наливается 0.10% раствор соляной кислоты. Потом выполняется забор исследовательского материала из кончика пальца в пипетку до отметки «0.04 мл». Впоследствии пипетку обтирают стерилизованной ваткой и размещают в мензурку с раствором HCl.
Медицинский сотрудник несколько раз встряхнет содержимое пробирки и поставит отстаиваться. Полное химическое превращение железосодержащего пептидного соединения в растворе соляной кислоты происходит не менее чем за 10-15 минут.
По истечении пяти минут оценивается цвет жидкости в гемометре со стандартными цветами. Как правило, он более темный, нежели в стандартных пробирках. Используя обычную пипетку к раствору постепенно добавляют чистую воду, попеременно перемешивая содержимое и сравнивая со стандартным цветом. На окончательном этапе цвет материала должен сравняться с нормативом. После всего вышеперечисленного замеряют уровень жидкости и проводят соответствующие подсчеты.
В промышленном масштабе выпускаются гемометры, которые содержат исключительно грамм-процентную градуированную шкалу. Нормой гемоглобина у мужчин и женщин принято считать значения 15 г%, или 168 г/дл. Но даже при соблюдении определенных правил наблюдаются небольшие погрешности в измерениях. В некоторых случаях разные результаты могут в значительной мере исказить данные о болезни.
Цианметгемоглобиновый метод определения содержания гемоглобина в крови
Стандартизированным и наиболее точным методом определения гемоглобина принято считать гемоглобинцианидный анализ. Такая методика базируется на свойстве железосодержащего пептидного соединения превращаться в цианметгемоглобин при добавлении к биологическому материалу определенного вещества.
Содержание цианметгемоглобина замеряют фотометрически. При анализе крови в роли реактива применяется раствор Драбкина. Железосодержащий белок под влиянием синеродисто-железистого калия превращается в метгемоглобин, который потом преобразуется в присутствии цианина калия в гемиглобинцианид.
Типичное соотношение разведения биологического материала с реагентом — 2 : 500 (0,04 миллилитров капель крови и 10 мл реактива). По истечении 30 минут, которые нужны для полного преобразования железосодержащего пептида в гемиглобинцианид, измеряют «гашение» при длине волны в 550 нанометров и плюс толщине слоя в 2 см против воды на спектрофотометре СФ или на ФЭК и ему похожей технике. С помощью СФ также измеряют уровень свободного железосодержащего пептида в плазме.
На данный момент разработаны гемиглобинцианидные цветовые стандарты в ампулах, которые точно соответствуют определенному уровню железосодержащего белка. Растворы, полученные в результате определенных реакций, исследуют с помощью колориметрии. После всего рисуют рабочие таблицы и узнают, какое количество железосодержащего пептидного соединения содержится в кровотоке.
Есть устройства, специально созданные для определения количества гемоглобина. Зачастую используются именно циангемоглобиновые методы определения гемоглобина. Как правило, гемоглобинометрические приборы могут работать самостоятельно. Широкое применение такие тест-устройства для определения гемоглобина в крови получили в домашних условиях. Однако в ряде ситуаций больные не учитывают влияние внешних факторов в доме (стресса, еды).
Другой набор методов диагностики уровня гемоглобина в крови
Значительную известность и распространение среди различных лабораторий получила методика гемихром (или гемихромный метод). Принцип данного метода основан на преобразовании всех форм железосодержащего пептида в гемихром, который имеет красноватый цвет. Преимущество гемихромного метода заключается в том, что он не является токсичным.
Иногда назначают прохождение биохимического исследования на гликированный гемоглобин. Стоит отметить, что важное значение гликозилированный гемоглобин и глюкометр имеют при диагностике сахарного диабета.
При определенных состояниях в моче может содержаться гемоглобин, поэтому нередко данная биологическая жидкость и ее анализы являются важными частями диагностики различных заболеваний. Такое случается при переливании несовместимой крови от донора, в особенности у ребенка.
Загрузка…
26 февраля 2019 г.
Гемоглобин (Hb) – молекула, с помощью которой переносится кислород. Она расположена внутри зрелых эритроцитов, лишенных ядер. Клетки получают кислород из альвеол легких, переносят его органам к клеткам-мишеням. От них получают углекислый газ, и переносят его обратно в легочную систему. Без этого действия невозможна жизнь человека. Существуют различные состояния, при которых гемоглобин может повышаться или снижаться. Для диагностики используют различные лабораторные методы определения функции соединения гемоглобина. Их подбирает врач индивидуально для каждого пациента.
Клиническое значение определения гемоглобина
У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:
- женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
- мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.
Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.
Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
- недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B12);
- заболевание красного костного мозга.
Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:
- повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
- компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
- снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.
Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.
Методы измерения гемоглобина в крови
Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:
- гемиглобинцианидный;
- гемихромный;
- Сали;
- аммиачный;
После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.
Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.
Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.
Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи
Унифицированные методы определения гемоглобина
Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.
Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.
Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови
У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.
Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.
Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).
Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.
Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!
Гемихромный метод определения гемоглобина в крови
С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).
Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.
Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.
Цианидный метод исследования гемоглобина в крови
Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.
В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.
Метод Сали для определения гемоглобина в крови
Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.
Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).
На нижнем мениске пробирки будет стоять цифра, которая указывает на содержание показателя в 100 г крови. Для вычисления концентрации в 1 литре, показатели умножают на 10. Процентное содержание Hb вычисляется с помощью пропорции:
16,7%=100
- А%=Х
- Х=А×100/16,7
- Х – определяемый показатель,
- А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
- 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.
Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина
Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:
- Оксигемоглобин;
- Дезоксигемоглобин;
- Карбоксигемоглобин;
- Метгемоглобин.
Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.
Аммиачный метод определения гемоглобина
Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.
Методы определения гемоглобина в моче
Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.
- Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
- Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
- Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
- Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.
Какой метод определения гемоглобина наиболее точный?
Наиболее точным методом определения показателя считается фотоколориметрический с использованием гемихромного разведения. С помощью него снижается риск врачебной ошибки. Прибор автоматически подсчитывает показатель. Здесь важно правильно подготовить приборы, пробирки, кюветы, настроить аппарат. Методика безопасна для лаборанта.
В определении Hb в моче наиболее информативным является использование тест-полосок. Здесь полностью исключается риск неправильного разведения реактивов.
Определение гемоглобина является важным информативным тестом. Можно определить кровотечение в мочевыводящих путях, состояние сердечно-сосудистой и легочной системы. С помощью методов вовремя выявляются различные виды анемии при низких концентрациях гемоглобина. После получения данных рекомендуется обратиться к лечащему врачу. Он расшифрует полученный результат, выявит нормы и отклонения, назначит лечение.
Узнай о методах определения гликозилированного гемоглобина в крови!
Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro
Полезное видео
Подсчет лимфоцитов: разновидности метода
Подсчет количества тромбоцитов в крови – подробно о методиках
Откуда лучше брать общий анализ крови – пальца или вены?
Подсчет количества эритроцитов: выбор лучшей методики
Анализ крови – один из самых необходимых. Определение концентрации гемоглобина в крови пациента позволяет выявить многие заболевания или пограничные состояния. Благодаря распространенным способам анализа исключают или выявляют анемии и следят за уровнем эритроцитов. Современные методики с точностью позволяют изучить состав кровяных телец и подсчитать их количество.
Клиническое значение определения гемоглобина
У мужчин показатель содержания гемоглобина в крови варьирует в пределах 120-160 г на литр, а у женщин – 110-150 г/л. Это объясняется тем, что мужчины более плотные по строению и имеют высокую мышечную массу. Иногда наблюдается снижение концентрации этого показателя в связи физиологическими и патологическими состояниями:
- беременность и послеродовой период;
- болезни костного мозга;
- недостаток витамина В12 и фолиевой кислоты;
- снижение количества эритроцитов из-за нехватки железа;
- кровопотери.
Наряду с анемией встречается и завышение показателя:
- избыток эритроцитов или эритроцитоз. Встречается при злокачественных новообразованиях и болезнях костного мозга;
- эритроцитоз вследствие заболеваний сердца и сосудов;
- снижение количества плазмы крови, что делает ее вязкой и увеличивает количество кровяных телец в литре биологической жидкости.
Гемоглобин образуется в красных кровяных клетках после утраты ядра и созревания клетки, период жизни которой длится не более 120 дней. После утилизации клетки в селезенке, в кровь выделяется железо, которое доставляется в костный мозг. Далее этого образуются новые эритроциты.
Методы измерения гемоглобина в крови
Для измерения показателя в крови используют несколько колориметрических способов:
- Гемиглобинцианидный.
- Гемихромный.
- Метод Сали.
- Аммиачный.
После любого из методов используют полуавтоматический анализатор, измеряющий спектр длины волны молекулы гемоглобина.
Автоматические методы не смогут распознать нарушения состава крови, но исключат ошибки в подсчёте параметров. Ручной метод используется с применением реактивов и биологической жидкости и способен определить лишь наличие или отсутствие клеток.
Гемиглобинцианидный метод
Гемоглобин имеет много форм, что затрудняет измерение его длины волны. Чтобы сделать процедуру проще, этот показатель переводят в метгемоглобин. Для точности результата используют специальное оборудование: мерные пробирки, фотоэлектроколориметр, трансформирующий раствор. Нормальный показатель длины волны – 540 нм, в этом диапазоне и работает прибор. Расчёты производят по формуле, а итоговый показатель переводят в граммы на литр (г/л).
Интересный факт!
Этот метод применяется для определения уровня гемоглобина все реже, в связи с опасностью для лаборантов, так как реактив может вызвать ожоги кожи и слизистых.
Гемихромный метод
С помощью безопасных специальных реактивов гемоглобин переводят в циангемоглобин. Для этого используют SDS, соли жирных кислот, четвертичный аммоний. В результате образуется гемихром, который также измеряется методом колориметрии в фотометре, при длине волны 540 нм. В конце также используют формулу для расчёта и переводят единицы измерения в г/л.
Плюсом такого метода можно назвать быстроту реакции и получение результата за считанные минуты. Лаборатории часто применяют этот метод с использованием реактивов Ольвекс. Они полностью безопасны, долговечны и экономичны.
Метод Сали
Более устаревший способ анализа, который используют редко. Принцип заключается в добавлении в биоматериал хлористоводородной кислоты, что помогает перевести гемоглобин в солянокислый гематин. Далее добавляют дистиллированную воду до коричневой окраски и сравнивают цвета с контрольной пробиркой. Отметка на пробирке указывает на количество вещества в 100 г крови. Для получения результата в литре показатели умножают на десять и вычисляют показатель с помощью пропорции.
Аммиачный метод
Этот метод основан на предыдущих, только в качестве раствора используют аммиак 0,04%. Пробу настаивают для перехода всех форм гемоглобина в одну. Далее рассчитывают результат с помощью фотометра при длине волны 543 нм. Наиболее точным считается гемихромный метод. Таким образом можно исключить риск ошибки, так как все расчеты ведут, основываясь на показателях прибора. Кроме того, этот способ наиболее безопасный и не несет вреда для лаборантов.
Гемоглобин — это важный показатель для врача и пациента. С помощью такого анализа можно судить о наличии заболевания, кровотечения и состояния сердечно-сосудистой системы. Важно проводить анализ с целью профилактики, чтобы не допустить анемию или патологическое превышение показателя. Полученные данные лаборатории должны быть интерпретированы врачом. Только так можно избежать осложнений заболеваний и получить правильное лечение.