Нормы крови у обезьян

БЭБИМ – в печати

Показатели физиологических параметров обезьян Масаса fasciсularis, иммунизированных  против вируса краснухи в сочетании с адъювантами на основе германия.

Карал-оглы Д.Д.*, Агрба В.З., * Лаврентьева И.Н.**, Амбросов И.В., *** Матело С.К.*** Чугуев Ю.П., *Гварамия И.А.,* Гвоздик Т.Е.,* Мухаметзянова Е.И .*

*Федеральное государственное бюджетное учреждение « Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» Российской академии медицинских наук

**Федеральное бюджетное учреждение науки “Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера”

*** ООО «ВДС Фарма»

_____________________________________________________________________________

На 26 Масаса fascicularis обоего пола были изучены клинический статус, гематологические, биохимические показатели, а также аллергенное действие германий органических соединений, использованных в качестве адъювантов в комплексе с препаратом из вакцинного штамма вируса краснухи  «Орлов» и препаратом сравнения – коммерческой вакциной против краснухи  на основе штамма «Wistar RA 27/3». Показано отсутствие различий в физиологических показателях организма обезьян, иммунизированных отечественным и зарубежным вакцинными  штаммами вируса краснухи без адъювантов и в сочетании с ними. Адъюванты не повлияли на показатели безвредности вакцинных препаратов (отсутствие токсичности, реактогенности, аллергенности) в доклинических испытаниях на низших приматах.

__________________________________________________________________________

Ключевые слова: макаки яванские (Масаса fasciсularis), гематология, биохимия, адъювант

Проблема краснухи- «легкого» детского заболевания – имеет высокую социальную значимость, т.к. эта инфекция у беременных женщин приводит к мертворождению или тяжелым поражениям плода – порокам сердца, слепоте, глухоте, умственной отсталости и в итоге к тяжелой инвалидности с детства [10]. Длительное время краснуха в нашей стране оставалась неуправляемой инфекцией в связи с отсутствием отечественных живых вакцин. Введение прививки против краснухи в Национальный календарь профилактических прививок иммунизации (Приказ МЗ РФ № 375 от 27.12.1997 г.) позволяет использовать зарубежные вакцины. Вместе с тем отечественными авторами выделен и  аттенуирован  штамм вируса краснухи «Орлов», который мог бы быть использован  в качестве отечественного вакцинного препарата [6]. В последние годы возросли требования к проведению отдельных этапов разработки новых медикаментозных средств, в частности, к стадии доклинических исследований, одним из важных разделов которых является проведение экспериментов на лабораторных животных [11]. И в этом плане на конечном этапе исследований эксперименты на обезьянах обеспечивают наиболее адекватные результаты, которые с минимальной коррекцией можно экстраполировать и на человека [4,7,5].

Целью настоящего исследования  явилось изучение физиологических параметров обезьян Масаса fuscicularis, иммунизированных препаратом из отечественного вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов», в сравнении с коммерческой вакциной против краснухи на основе штамма «Wistar RA27/3» (производства  Серум Инститьют, Индия)  в опыте на  макаках яванских Macaca fascicularis разного пола.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Исследование проводили на 26 половозрелых макаках яванских, разделенных на 2 группы по13 обезьян в каждой. Каждая группа обезьян состояла из 5  самок и 8 самцов, возрастом  4-5 лет, вес в диапазоне  2670 – 5240 г.  Были сформированы 2 группы, состоящие из 3 подгрупп: по 3 обезьяны в контроле и по 10 обезьян в опыте. Вакцину, разведенную в физ. растворе, вводили под кожу правого предплечья в объеме 0,5 мл.

Животных содержали в индивидуальных жилых клетках, оборудованных автоматическим поением, при температуре в вентилируемых  помещениях  18-22 0С.  Животные были адаптированы к условиям содержания и персоналу в течение 1 месяца. Кормили животных  брикетированными кормами, сбалансированными по всем показателям с добавлением  зеленых кормов и фруктов. Ежедневно, кроме брикетов, обезьяны получали яйца, яблоки и гематоген (1/6 часть стандартной пластинки).

Все исследования на обезьянах проводили в строгом соответствии с  требованиями комитета по биоэтике и  федеральным  законом РФ о защите животных от жестокого обращения (ст. 4  Закона РФ о защите животных от жестокого обращения от 01 декабря 1999 г).

Адъюванты. Использованы германий органические соединения ГОС 1 (WDS-14) и ГОС 2 (энигерманий). Концентрация препаратов германия в прививочной дозе –  2 мг/0,5 мл.

Гематологический анализ крови обезьян проводили  на гематологическом анализаторе фирмы «Beckman 5 diff»,USA. В некоторых случаях формулу крови уточняли  при микроскопировании  мазков, окрашенных по Романовскому-Гимза по общепринятой методике [9,3].

Биохимический анализ сывороток крови обезьян проводили на биоанализаторе ВIOCHEM SA (High Technology Inc.,USA) с набором реактивов этой же фирмы [8,2].

Аллергенное действие изучали путем  исследования сыворотки крови обезьян на присутствие антител  класса IgE. Анализ производили с использованием диагностических наборов производства фирмы «Вектор Бест», Новороссийск.  Оптическую плотность измеряли с использованием фильтра 450 нм на автоматическом фотометре  «Униплан» фирмы «ПИКОН», Россия. Измерения проводили не позднее 10-15 мин после остановки реакции. Результаты анализа считали положительными, если значения оптической плотности (ОП) в соответствующей лунке было равно или превышало критическое значение (ОПк), которое вычисляли по формуле: ОПк = ОПср(К-) +0,1,где ОПср(К-)- среднее значение ОП отрицательных сывороток, установленный на предприятии производителя [1]

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Безопасность применения фармакологических и иммунологических препаратов, вводимых людям, наиболее важный  критерий возможности их  использования [11]. Поэтому на первом этапе исследования определяли безвредность адъювантов по следующим  критериям:

–  наличие/отсутствие  местных и общих реакций на введение препаратов в клинических наблюдениях за иммунизированными животными;

– исследованием клинических и биохимических показателей периферической крови подопытных животных;

-наличие/отсутствие аллергенного воздействия, определяемое по уровню IgE .

Клинические наблюдения за иммунизированными животными

Через 24 часа после вакцинации и в течение последующих 30 суток на месте введения никаких реакций (покраснение, отек, расчесы)  не  отмечалось.

Для оценки общих реакций на введение исследуемых препаратов у животных определяли:

– объем и силу движений в конечностях. Для определения этих показателей наблюдали типичные движения обезьян в клетках (прыжки, лазанье, захват предметов) и оценивали их способность сопротивляться извлечению из клетки и насильственному разгибанию и сгибанию конечностей;

– координацию движений (статическая мозжечковая атаксия) оценивали по способности животных сохранять равновесие при перемещении по клетке, по  способности совершать координированные движения конечностями при лазаньи и захватывании предметов;

–  мышечный тонус определяли при пальпировании мышц конечностей в спокойном состоянии и при сгибании-разгибании.

Определяли также наличие тремора, гиперкинезы.

За весь период наблюдения видимых местных и общих реакций на введение препаратов у обезьян отмечено не было.

Определение токсичности  исследуемых препаратов

Возможное токсическое воздействие исследуемых препаратов оценивали по их воздействию на клетки периферической крови, а также по оценке биохимических показателей. Гематологические показатели, полученные до- и после  иммунизации животных и  на контрольной группе обезьян, представлены в таблице 1.

  Таблица1.Гематологические показатели обезьян, иммунизированных разными штаммами вируса краснухи в сочетании с адъювантами на основе германия

Анализируя  результаты гематологических исследований  обезьян, иммунизированных каждым из вакцинных штаммов, как без адъювантов, так и при их использовании, следует обратить внимание на то, что у    животных всех подгрупп выявляются однотипные изменения. Исходный эритроцитоз у всех животных связан с определенной дегидратацией, вызванной высокой  температурой внешней среды в летнее время  и дефицитом  воды в общей системе поения обезьян. С неспецифическим эритроцитозом  связано и низкое содержание гемоглобина в 1 эритроците (MCH) при нормальном  среднем содержании гемоглобина в общей массе эритроцитов  (MCHC). Эти  колебания состояния кроветворной системы  макаков яванских регистрируются у обезьян всех групп, но, в целом, не  выходят за границы нормативных показателей и не являются следствием иммунизации. Важно отметить, что при исследовании гематограмм и мазков крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, не было обнаружено каких-либо  патологических изменений клеток крови, указывающих на токсическое действие исследуемых препаратов, а именно: зернистости эритроцитов, лейкопении, появления незрелых форм лейкоцитов, эозинофилии, изменения формулы крови.

Результаты биохимического  анализа  крови исследуемых животных  представлены в таблице 2. Существенных и закономерных изменений показателей у обезьян всех подгрупп, как до, так и после иммунизации в сравнении с обезьянами в контрольной группе, не выявлено. Незначительное увеличение уровня трансаминаз (АлТ, АсТ) и увеличение показателей щелочной фосфатазы (как у контрольных, так и  у экспериментальных  обезьян) связано с особенностями рациона питания животных и временем забора крови, предшествующим кормлению. Отсутствие значимых изменений в уровне  сывороточных белков крови указывает на сохранность  синтетической функции печени  при применении  ГОС. Нормальный уровень сывороточного креатинина на протяжении всего периода наблюдения подтверждает отсутствие как острой, так и хронической нефротоксичности препаратов и сохранность функции почек.

Показатели липидного обмена, обусловленные половозрастной нормой и характером питания, находятся в пределах референтных значений как в опытных, так и в контрольных группах.

В целом, при исследовании стандартными общепринятыми  гематологическими и биохимическими методами  сывороток крови обезьян опытных и контрольных групп токсического воздействия исследуемых препаратов не обнаружено.

Таблица 2.Биохимические показатели макаков яванских, иммунизированных штаммами вируса краснухи

В динамике определяли концентрацию Ig E в сыворотке крови обезьян (таблица 3).

Таблица 3. Концентрация IgE в сыворотке крови экспериментальных обезьян в динамике.

Как следует из таблицы 3,иммунизация обезьян  препаратом из вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» в сравнении с коммерческой живой аттенуированной краснушной вакциной из штамма  «Wistar RA27/3»  в сочетании с адъювантами на основе германия не вызывает уживотных  повышения концентрации IgE и находится у всех животных на уровне референтных значений.

Ранее, в опыте на обезьянах макака резус, была установлена специфическая безопасность вакцинного штамма «Орлов»  [4,6].

Проведенное исследование показало, что использование германий органических соединений в качестве адъювантов при иммунизации обезьян Масаса fascicularis против краснухи не оказывает негативного воздействия на вакцинные препараты по критерию безопасности их применения: реактогенности, аллергенности, токсичности.

Литература:

1.    Долгов В.В., Ракова Н.Г., Колупаев ВЕ., Рытикова Н.С. Иммуноферментный анализ. Москва, 2007, стр. 209-232.
2.    Долгов М., Морозова В., Марцишевская Р.  и др. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей. –Москва .: Центр.-1995.-С.209.
3.    Куксова М.И. Кроветворная система обезьян в норме и патологии. М. «Медицина», 1972, 128С.
4.    Лаврентьева И.Н., Жебрун А.Б., Агрба В.З., Яковлева Л.А. Обезьяны макака резус как модель для доклинического изучения вакцинных штаммов вируса Краснухи//Материалы Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях. Сочи-Адлер, 2006, с.38-43.
5.    Лаврентьева И.Н., Сухобаевская Л.П., Агрба В.З. и др. Доклиническое изучение штамма «Орлов-В» на обезьянах как ключевой этап оценки пригодности аттенуированного вируса для получения живой вакцины против краснухи. В кн. «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской приматологии» , Сочи-Адлер, 2011, стр.206-212.
6.    Лаврентьева И.Н., Сухобаевская Л.П.,  Агрба В.З., Яковлева Л.А., Радюкевич Ю.А., Жебрун А.Б. Штаммы вируса Краснухи для живой аттенуированной вакцины//Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2003,№4, с.7-10
7.    Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Фридман Э.П. Руководство по медицинской приматологии. М., 1987
8.    Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика./Из-во «Гиппократ», С-Петербург,1995,205с.
9.    Руководство по клиническим лабораторным исследованиям (основанное В.Е.Предтеченским). Под редакцией Л.Г.Смирновой и Е.А.Кост. Медгиз. Москва, 1960, стр. 7-40
10.    Семериков В.В., Лаврентьева И.Н., Таточенко В.К., Нисевич Л.Л., Фельдблюм И.В. Краснуха//Пермь-Санкт-Петербург-Москва, 2002, 174с.
11.    Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005, 774С.

Адрес для корреспонденции:

Карал-оглы Джина Джинаровна-Karal-ogly Djina Djinarovna 

Адрес: 354376,Сочи-А,Веселое-1, ФГБУ «НИИ МП» РАМН

Тел: сот.8(928) 449 34 38

E-mail: karal@primatologia.ru 

Лаврентьева Ирина Николаевна-Lavrentyeva Irina Nikolaevna 

Амбросов Игорь Валерьевич –Ambrosov Igor Valerievich 

Матело С.К. – Matelo Cvetlana Konstantinovna 

Агрба Виолета Засимовна-Agrba Violeta Zasimovna 

Чугуев Юрий Петрович-Chuguev Uriy Petrovich 

Гварамия Ирина Алексеевна-Gvaramiya Irina Alekseevna 

Гвоздик Татьяна Евгеньевна-Gvozdik Tatiana Evgenievna 

Мухаметзянова Евгения Ильдаровна-Mukhametzyanova Evgeniya Il’darovna