Построение калибровочного графика гемоглобин
Исследование содержания гемоглобина в крови (гемоглобинометрия) включает определение гемоглобина и его дериватов, которые присутствуют в крови здоровых людей или появляются при различных патологических состояниях. У здоровых людей гемоглобин находится в крови, главным образом, в виде оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве — метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина.
Для определения концентрации гемоглобина наиболее часто применяются колориметрические методики, основанные на том, что присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски.
Унифицированная гемиглобинцианидная методика
Принцип. Гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием, который, вступая в реакцию с ацетонциангидрином, образует окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид). Интенсивность окраски раствора цианметгемоглобина пропорциональна содержанию гемоглобина.
Реактивы:
- 1) трансформирующий раствор: натрия гидрокарбонат (NaHCO3) — 1,0 г; ацетонциангидрин — 0,5 мг; калий железосинеродистый (красная кровяная соль, K3[Fe(CN)6)] — 0,2 г; дистиллированная вода — до 1 л. Раствор желтого цвета, прозрачный; при обесцвечивании или появлении осадка непригоден. Реактив считается годным для употребления в течение нескольких месяцев после приготовления при хранении в посуде из темного стекла;
- 2) стандартный калибровочный раствор гемиглобинцианида промышленного изготовления (лучше от фирмы-лидера на рынке диагностического оборудования). Например, стандартный раствор фирмы «Иммуна» имеет концентрацию гемиглобинцианида 61,23 мг/100 мл, что соответствует концентрации гемоглобина в крови 15,4 г/100мл при разведении в 251 раз. Хранят в холодильнике в незамороженном виде, защищая от света.
Ход определения. В пробирку, содержащую 5 мл трансформирующего раствора, добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Хорошо перемешивают и оставляют стоять 10 мин. Фотометрируют при длине волны 500—560 им (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы (трансформирующий раствор). Измеряют в тех же условиях стандартный раствор. Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по разведениям стандартного раствора гемиглобинцианида в трансформирующем растворе (см. табл. «Приготовление разведений стандартного раствора гемиглобинцианида для построения калибровочного графика»).
Приготовление разведений стандартного раствора гемиглобинцианида для построения калибровочного графика
| № пробирки | Стандартный раствор, мл | Трансформирующий раствор, мл | Концентрация гемоглобина, г/л |
| 1 | — | 6 | Контрольная проба |
| 2 | 2 | 4 | 50 |
| 3 | 4 | 2 | 100 |
| 4 | 6 | — | 150 |
По оси абсцисс откладывают известные цифры концентрации гемоглобина, а по оси ординат — показатели оптической плотности со шкалы прибора либо рассчитанные по формуле:
Hb (г/л) = Eоп/Eст. × С × К × 0,01,
где Eоп — экстинкция опытной пробы; Eст — экстинкция стандартного раствора; С — концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг/100мл; К — коэффициент разведения крови; 0,01 — коэффициент для пересчета в г/л.
Определение гемоглобина гематологическими анализаторами также основано на методе колориметрии. Ход исследования осуществляется согласно инструкции к набору реактивов.
Нормальные величины
У здоровых людей концентрация гемоглобина в крови составляет:
- мужчины — 132–164 г/л;
- женщины — 120–145 г/л;
- новорожденные (кровь из пуповины) — 135–195 г/л;
- дети 1 года — 110–130 г/л;
- дети 10–12 лет — 115–145 г/л.
Дневные колебания. Показатели содержания гемоглобина минимальны утром и максимальны вечером. Значимым изменением уровня гемоглобина считается 15 г/л или более.
Клиническое значение. Содержание гемоглобина в крови ниже нормы для данного пола и возраста называют анемией. Согласно критериям ВОЗ, анемия как клинический синдром определяется при снижении концентрации гемоглобина в периферической крови ниже 110 г/л для любого возраста и пола.
Следует иметь в виду, что диагностика анемии не может проводиться лишь на основании определения концентрации гемоглобина в крови. Это исследование только устанавливает факт наличия анемии. Для уточнения ее характера необходимо определение количества эритроцитов, цветового показателя, изучение морфологии эритроцитов и других показателей.
Наибольшее развитие получили колориметрические методы определения концентрации гемоглобина, основанные на колориметрии производных гемоглобина. К унифицированным методам относится гемиглобинцианидный метод, при проведении которого гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием. Образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически.
Пробирку со смесью трансформирующего раствора и крови (см. табл. 1, 2) инкубируют 10 минут. Измеряют на ФЭК при длине волны 500–560 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). В тех же условиях проводят измерение стандартного раствора.
Расчет содержания гемоглобина проводят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида.
Стандартный (калибровочный) раствор гемиглобинцианида изготавливается предприятиями (фирмами), выпускающими химические реактивы для лабораторных исследований, и входит в специальные наборы для определения концентрации гемоглобина. Стандартный раствор имеет известную концентрацию гемиглобинцианида, указанную на упаковке набора. Приготавливая ряд разведений этого раствора гемиглобинцианида и измеряя их оптическую плотность, проводят построение калибровочного графика.
2.2.3. Определение количества клеток крови
путем подсчета в камере Горяева
Камера Горяева является вариантом гемоцитометра, или счетной камеры, и представляет собой специальное стекло, в углублении которого (0,1 мм) нанесена сетка с большими и малыми квадратами строго определенного размера.
Перед работой камеру Горяева тщательно протирают сухой салфеткой и притирают к ее поверхности покровное стекло таким образом, чтобы по его краям появились радужные полосы.
Камеру заполняют суспензией крови и разводящего раствора (см. табл. 1, 2), оставляют на горизонтальной поверхности около 1 минуты для оседания клеток крови и затем микроскопируют на малом увеличении светового микроскопа при опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме для лучшего контрастирования клеток.
Определениеколичества эритроцитов проводят в пяти больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 4000 ´ 200) / 80 = a ´ 10 000,
где а – количество подсчитанных эритроцитов.
Для определения количества эритроцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
Определениеколичества лейкоцитов проводят в 100 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (20), числа подсчитанных квадратов (100) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 250 ´ 20) / 100 = a ´ 50,
где а – количество подсчитанных лейкоцитов.
Для определения количества лейкоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
Определениеколичества тромбоцитов проводят в 25 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (25) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 250 ´ 200) / 25 = a ´ 2 000.
Для определения количества тромбоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
3. Автоматические анализаторы
для проведения общего анализа крови
В настоящее время ручные методы определения основных гематологических показателей (число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, концентрации гемоглобина, оценка морфологии и размеров эритроцитов и др.) вследствие высокой степени субъективизма постепенно выводятся из применения. Такие методы отличаются от автоматических только одним преимуществом – возможностью проведения в любых условиях без специального дорогостоящего оборудования.
Более точными методами определения гематологических показателей являются автоматические. Их развитие прошло более чем 30‑летний путь – от полуавтоматических одноканальных приборов до мульти-параметрических анализаторов, которые определяют более 20 показателей со скоростью 120 проб крови в час.
Все приборы для проведения автоматического гематологического анализа можно разделить на две группы – автоматические счетчики клеток и автоматические анализаторы клеток.
В автоматических счетчиках клеток крови применяются:
* кондуктометрический принцип – определение изменений электрического сопротивления при пропускании суспензии клеток через отверстие малого диаметра (Coulter, Sysmex, Celloscope). Этот тип счетчиков позволяет определять количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, измерять объем клеток, размеры клеток. Результаты могут представляться как в цифровом виде, так и в виде гистограмм распределения. Данные фиксируются в памяти приборов;
* принцип проточной цитометрии позволяет определять концентрацию гемоглобина в каждом эритроците, а затем происходит построение гистограммы распределения клеток не только по объему, но и по концентрации гемоглобина. В этом случае вводится новый показатель, характеризующий гетерогенность пула эритроцитов, – ширина распределения эритроцитов по концентрации гемоглобина.
Автоматические анализаторы клеток дают возможность получить не только количественные и производные от них параметры, но и данные, позволяющие дифференцировать различные популяции и субпопуляции клеток (преимущественно, лейкоцитов). В основном выделяют два типа автоматов:
1) анализ клеточного изображения с дифференцировкой клеток по созданной компьютерной модели распознавания. Эти приборы дают возможность получения визуальной информации и ее сохранения в памяти компьютера;
2) проточные системы, различающие разные клетки по их размерам и особенностям окрашивания. Преимущество этих приборов в высокой производительности и большом количестве возможных параметров (до 36).
В основе работы проточных систем лежат различные методы:
1) кондуктометрический – измерение сопротивления клетки в постоянном электрическом поле;
2) радиочастотный – амплитуда сигналов при прохождении клетки через апертуру зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений, т. е. учитываются сигналы, отражающие характер внутренней структуры клетки;
3) регистрация светорассеяния и поглощения – оптические детекторы. Работа оптических детекторов основана на действии лазерного луча, который пропускают через суспензию клеток. При пересечении луча клеткой происходит поглощение и рассеяние света. Различия этих процессов зависят от свойств клеток – размеров, формы, плотности, гранулярности цитоплазматических структур;
4) флюориметрия – измерение флюоресценции красителей, которые избирательно связываются с клеточными структурами. Основное применение метода связано с иммунофенотипированием и анализом содержания ДНК, что позволяет провести диагностику онкогематологических заболеваний, а также исследование иммунной системы;
5) изучение поляризации флюоресценции, которое позволяет оценить текучесть мембран, отражающее функциональное состояние клеток. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. Разница интенсивности поляризованного света позволяет установить активность вращения молекул клеточной мембраны.
Все эти подходы используются для создания современной диагностической базы, а именно цитометрии. Основными достоинствами автоматических счетчиков и анализаторов клеток являются их быстродействие, которое дает возможности проведения скрининговых исследований, небольшой объем исследуемого материала (крови), значительное число получаемых параметров, часть из которых – расчетные, автоматизированная обработка данных с возможностью сохранения информации и ее наглядного представления.
4. Физиологические уровни
показателей периферической крови
Показатели периферической крови у здоровых людей приведены в табл.4.
Таблица 4. Показатели периферической крови у здоровых людей
| Показатель, единицы | Нормальные значения |
| Гемоглобин, г/л | 122–154 (муж.), 115–135 (жен.) |
| Эритроциты, ´1012/л | 4–5,1(муж.), 3,7–4,7 (жен.) |
| Лейкоциты, ´109/л | 4,0–8,8 |
| Тромбоциты, ´1010/л | 1,8–3,2 |
| СОЭ, мм/час | 1,0–10,0(муж.), 2,0–15,0 (жен.) |
Наибольшее развитие получили колориметрические методы определения концентрации гемоглобина, основанные на колориметрии производных гемоглобина. К унифицированным методам относится гемиглобинцианидный метод, при проведении которого гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинеродистым калием. Образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют колориметрически.
Пробирку со смесью трансформирующего раствора и крови (см. табл. 1, 2) инкубируют 10 минут. Измеряют на ФЭК при длине волны 500–560 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (трансформирующий раствор). В тех же условиях проводят измерение стандартного раствора.
Расчет содержания гемоглобина проводят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида.
Стандартный (калибровочный) раствор гемиглобинцианида изготавливается предприятиями (фирмами), выпускающими химические реактивы для лабораторных исследований, и входит в специальные наборы для определения концентрации гемоглобина. Стандартный раствор имеет известную концентрацию гемиглобинцианида, указанную на упаковке набора. Приготавливая ряд разведений этого раствора гемиглобинцианида и измеряя их оптическую плотность, проводят построение калибровочного графика.
2.2.3. Определение количества клеток крови
путем подсчета в камере Горяева
Камера Горяева является вариантом гемоцитометра, или счетной камеры, и представляет собой специальное стекло, в углублении которого (0,1 мм) нанесена сетка с большими и малыми квадратами строго определенного размера.
Перед работой камеру Горяева тщательно протирают сухой салфеткой и притирают к ее поверхности покровное стекло таким образом, чтобы по его краям появились радужные полосы.
Камеру заполняют суспензией крови и разводящего раствора (см. табл. 1, 2), оставляют на горизонтальной поверхности около 1 минуты для оседания клеток крови и затем микроскопируют на малом увеличении светового микроскопа при опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме для лучшего контрастирования клеток.
Определениеколичества эритроцитов проводят в пяти больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 4000 ´ 200) / 80 = a ´ 10 000,
где а – количество подсчитанных эритроцитов.
Для определения количества эритроцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
Определениеколичества лейкоцитов проводят в 100 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (20), числа подсчитанных квадратов (100) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 250 ´ 20) / 100 = a ´ 50,
где а – количество подсчитанных лейкоцитов.
Для определения количества лейкоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
Определениеколичества тромбоцитов проводят в 25 больших квадратах. Расчет в 1 мкл крови производится, исходя из разведения крови (200), числа подсчитанных квадратов (25) и объема 1 большого квадрата (1/250 мкл), по следующей формуле:
X = (a ´ 250 ´ 200) / 25 = a ´ 2 000.
Для определения количества тромбоцитов в 1 мл или в 1 л крови полученный показатель соответственно умножают на 103 или 106.
3. Автоматические анализаторы
для проведения общего анализа крови
В настоящее время ручные методы определения основных гематологических показателей (число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, концентрации гемоглобина, оценка морфологии и размеров эритроцитов и др.) вследствие высокой степени субъективизма постепенно выводятся из применения. Такие методы отличаются от автоматических только одним преимуществом – возможностью проведения в любых условиях без специального дорогостоящего оборудования.
Более точными методами определения гематологических показателей являются автоматические. Их развитие прошло более чем 30‑летний путь – от полуавтоматических одноканальных приборов до мульти-параметрических анализаторов, которые определяют более 20 показателей со скоростью 120 проб крови в час.
Все приборы для проведения автоматического гематологического анализа можно разделить на две группы – автоматические счетчики клеток и автоматические анализаторы клеток.
В автоматических счетчиках клеток крови применяются:
* кондуктометрический принцип – определение изменений электрического сопротивления при пропускании суспензии клеток через отверстие малого диаметра (Coulter, Sysmex, Celloscope). Этот тип счетчиков позволяет определять количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, измерять объем клеток, размеры клеток. Результаты могут представляться как в цифровом виде, так и в виде гистограмм распределения. Данные фиксируются в памяти приборов;
* принцип проточной цитометрии позволяет определять концентрацию гемоглобина в каждом эритроците, а затем происходит построение гистограммы распределения клеток не только по объему, но и по концентрации гемоглобина. В этом случае вводится новый показатель, характеризующий гетерогенность пула эритроцитов, – ширина распределения эритроцитов по концентрации гемоглобина.
Автоматические анализаторы клеток дают возможность получить не только количественные и производные от них параметры, но и данные, позволяющие дифференцировать различные популяции и субпопуляции клеток (преимущественно, лейкоцитов). В основном выделяют два типа автоматов:
1) анализ клеточного изображения с дифференцировкой клеток по созданной компьютерной модели распознавания. Эти приборы дают возможность получения визуальной информации и ее сохранения в памяти компьютера;
2) проточные системы, различающие разные клетки по их размерам и особенностям окрашивания. Преимущество этих приборов в высокой производительности и большом количестве возможных параметров (до 36).
В основе работы проточных систем лежат различные методы:
1) кондуктометрический – измерение сопротивления клетки в постоянном электрическом поле;
2) радиочастотный – амплитуда сигналов при прохождении клетки через апертуру зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений, т. е. учитываются сигналы, отражающие характер внутренней структуры клетки;
3) регистрация светорассеяния и поглощения – оптические детекторы. Работа оптических детекторов основана на действии лазерного луча, который пропускают через суспензию клеток. При пересечении луча клеткой происходит поглощение и рассеяние света. Различия этих процессов зависят от свойств клеток – размеров, формы, плотности, гранулярности цитоплазматических структур;
4) флюориметрия – измерение флюоресценции красителей, которые избирательно связываются с клеточными структурами. Основное применение метода связано с иммунофенотипированием и анализом содержания ДНК, что позволяет провести диагностику онкогематологических заболеваний, а также исследование иммунной системы;
5) изучение поляризации флюоресценции, которое позволяет оценить текучесть мембран, отражающее функциональное состояние клеток. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. Разница интенсивности поляризованного света позволяет установить активность вращения молекул клеточной мембраны.
Все эти подходы используются для создания современной диагностической базы, а именно цитометрии. Основными достоинствами автоматических счетчиков и анализаторов клеток являются их быстродействие, которое дает возможности проведения скрининговых исследований, небольшой объем исследуемого материала (крови), значительное число получаемых параметров, часть из которых – расчетные, автоматизированная обработка данных с возможностью сохранения информации и ее наглядного представления.
4. Физиологические уровни
показателей периферической крови
Показатели периферической крови у здоровых людей приведены в табл.4.
Таблица 4. Показатели периферической крови у здоровых людей
| Показатель, единицы | Нормальные значения |
| Гемоглобин, г/л | 122–154 (муж.), 115–135 (жен.) |
| Эритроциты, ´1012/л | 4–5,1(муж.), 3,7–4,7 (жен.) |
| Лейкоциты, ´109/л | 4,0–8,8 |
| Тромбоциты, ´1010/л | 1,8–3,2 |
| СОЭ, мм/час | 1,0–10,0(муж.), 2,0–15,0 (жен.) |
Date: 2015-07-02; view: 653; Нарушение авторских прав