Спектры поглощения соединения гемоглобина

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГОСУДАРСТВЕННАЯ

ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ СРЕДНЯЯ ШКОЛА № 28 Г. ВИТЕБСКА»

СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА И ЕГО

ПРОИЗВОДНЫХ У ЖИВОТНЫХ

Исполнители:

Шустова О.С., Савицкая Т.В.,  9 «Б» класс

Научные руководители:

Баран В.П., кандидат биологических наук, доцент УО «Витебская ордена «Знак почета» государственная  академия ветеринарной медицины»

Баран Е.Н., учитель биологии

Хвалько Н.Г., учитель физики

2008 г.

Цель: Исследование спектров поглощения гемоглобина и его производных у различных видов животных.

Задачи: 1)Определение содержания гемоглобина в крови животных; 2) Определение спектров поглощения оксигемоглобина, дезоксигемоглобина и метгемоглобина в крови  кролика, овцы, теленка.

Гемоглобин – это глобулярный белок способный связывать и переносить молекулярный кислород. Гемоглобин является основным компонентом эритроцитов теплокровных животных. Он является основным компонентом эритроцитов высших животных. В одном эритроците содержится около 280 миллионов молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 10 тысяч атомов водорода, углерода, азота, кислорода, серы и железа. Молекулярная масса гемоглобина человека равна 68000

Гемоглобин относят к сложным белкам, в составе которого в качестве небелковой части  выступает порфириновое ядро гемма, которое связано с белком глобином. Гемм по строению одинаков у различных видов животных, а видовые различия  гемоглобина связаны со строением глобина.

Основная функция гемоглобина – обратимое связывание молекулярного кислорода и доставка его во все клетки организма и связывание углекислого газа в тканях и его транспортировка к легким. В состоянии покоя  в крови растворяется до 200 мл кислорода в минуту. При сильных физических нагрузках количество растворенного кислорода увеличивается в 10 раз до 2-3 л в минуту. В среднем  грамм гемоглобина поглощает до 1,34 мл кислорода.

Гемоглобин – представитель гемопротеинов, т.е. группы сложных белков. Молекула его состоит из четырех субъединиц – двух α и двух β- субъединиц. Полипептидная цепь каждой из субъединиц специфическим образом уложена вокруг большого плоского железосодержащего гема. Все четыре цепи гемоглобина сходны между собой по форме. Форма и функция гемоглобинов различных животных сходны, однако аминокислотный состав их различается и тем сильнее, чем дальше эволюционно они удалены друг от друга.

Гем только в связи с нативным глобином способен лабильно связывать кислород. При поглощении кислорода β-цепи гемоглобина сближаются, при отдаче его – расходятся. Положение α-цепей при этом не меняется. Следовательно, присоединение и отдача кислорода молекулой гемоглобина сопровождается изменением его структуры, что приводит к изменению спектра поглощения гемоглобина. Присоединив молекулу кислорода, гемоглобин переходит в оксигенированную форму (HbO2) [2.503,585].

При присоединении к молекуле  гемоглобина  углекислого газа образуется карбоксигемоглобин. Таким образом,  углекислый газ переносится от тканей к легким. Если на гемоглобин  подействовать сильными окислителями (оксидами азота, парами нитробензола и другим  сильными окислителями) он превращается в метгемоглобин (HbOH). В метгемоглобине железо находится в трехвалентном состоянии, в то время как в восстановленном  и в оксигенированном гемоглобине – в двухвалентном. Метгемоглобин  вне организма образуется при длительном  выдерживании на воздухе растворов оксигемоглобина. Каждая форма гемоглобина характеризуется определенным спектром поглощения, представляющим собой зависимость оптической плотности раствора гемоглобина от длины волны света.

По литературным данным наиболее интенсивной полосой в спектре поглощения гемоглобина является полоса Соре, принадлежащая порфириновой части его молекулы. По изменению положения и интенсивности поглощения этой полосы можно судить о структурных изменениях молекул различных форм гемоглобина (таблицу 1).

Спектры поглощения различных форм гемоглобина  применяются в клинической практике при  выявлении отравлений у человека и животных, а  также  в судебной медицинской  и ветеринарной практике.

Таблица 1- Спектральные характеристики различных форм гемоглобина человека

Материалы и методы исследований. Для проведения исследований использовали венозную кровь кролика, овцы, теленка, стабилизированную гепарином, растворенным в 0,85%  растворе хлорида натрия. Схема эксперимента состояла из четырех этапов: 1)Определение содержания гемоглобина в крови животных; 2) Определение спектров поглощения оксигемоглобина, дезоксигемоглобина и метгемоглобина. Материалом для исследований служила цельная стабилизированная кровь кролика, овцы, теленка, гемолизаты эритроцитов.

Исследование содержания гемоглобина в крови животных проводили гемиглобинцианидным методом с использованием наборов НТПК «Анализ Х». Стабилизированную кровь добавляли к 5 мл трансформирующего раствора. В интервале 10-45 минут содержание гемоглобина  определяли   фотометрией на фотоэлектроколориметре КФК-3 при длине волны 540 нм против трансформирующего раствора.  Определение спектров поглощения проводили в гемолизатах крови животных, приготовленных из эритроцитарной суспензии. Для получения  эритроцитарной суспензии  стабилизированную кровь центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин. Полученную плазму отбирали, проводили четырехкратную отмывку эритроцитов 0,85% раствором NaCl с последующим центрифугированием. Гемолиз эритроцитов проводили дистиллированной водой. Восстановленный гемоглобин получали  добавлением к раствору оксигемоглобина насыщенного раствора  сульфата аммония.  Раствор метгемоглобина – добавлением раствора железосинеродистого калия. Исследование  спектров поглощения различных форм гемоглобина проводили в его растворах с конечным разведением 1:25. Спектры поглощения снимали на спектрофотометре СФ-46 в интервале длин волн 380-600 нм.

Собственные исследования. В результате исследования содержания гемоглобина в крови животных было установлено, что  уровень гемоглобина в крови овцы  136,35 г/л,  теленка -106,01 г/л,  кролика-100,75 г/л и находился  в пределах физиологической нормы.

Рисунок 1.- Содержание гемоглобина в крови различных сельскохозяйственных животных

Исследование спектров поглощения показало, что оксигемоглобин кролика максимальную оптическую плотность проявлял при 415, 540 и 580 нм (рис. 2). В тоже время оксигемоглобин теленка аналогичные свойства проявлял при 400,420,540 и 580 нм. Спектры поглощения оксигемоглобина овцы имели ряд особенностей, поскольку  максимум оптической плотности проявлялся  в интервале 410-420 нм, а  также при 540 и 580 нм. Обращает на себя внимание сходность  спектров поглощения всех исследованных животных  при высоких длинах волн. В тоже время  существенные различия проявляются  в интервале 400-420 нм, что связано со свойствами и строением белковой молекулы.

Рисунок 2.-Спектры поглощения  оксигемоглобина у различных видов сельскохозяйственных животных

При исследовании спектров поглощения восстановленного гемоглобина (рис. 3) было установлено, что дезоксигемоглобин кролика имел максимумы поглощения в интервале 410-420 нм, а также при 540 и 580 нм. Оптическая плотность  восстановленного гемоглобина овцы  была максимальной  при 415, 540, 580 нм. Спектры поглощения восстановленного гемоглобина теленка имели ряд  особенностей. Обращает на себя внимание примерно сходные  высокие величины оптической плотности  в интервале 400-420 нм, пики при 540 и 580 нм, и минимальным значением оптической плотности при 520 нм, чего не регистрировалось у других животных.

В результате исследования спектров поглощения метгемоглобина (рис.4) кролика  было выявлено, что максимумы поглощения проявлялись при  415, 540, 580 нм и минимум поглощения – при 500 нм. Метгемоглобин овцы  проявлял максимальные значения оптической плотности в интервале 410-415 нм, а также при 535 нм, имел минимальные значения при 580 нм. Метгемоглобин теленка  характеризовался  двумя интервалами максимумов оптической плотности  при 400-420 нм и 535-540нм, при этом регистрировался минимум поглощения при 580 нм.

Рисунок 3.-Спектры поглощения  восстановленного гемоглобина различных видов сельскохозяйственных животных

Рисунок 4.-Спектры поглощения метгемоглобина различных видов сельскохозяйственных животных

Выводы:

1.Наиболее значимые различия по спектрам поглощения окси- и дезоксигемоглобина выявлены в интервале 410-425 нм. Максимумы поглощения окси- и дезоксигемоглобина кролика и овцы при 415нм, теленка-420 нм. Спектры поглощения гемоглобина и дезоксигемоглобина у животных в зелено-желтой части спектра  сходны.

2. Метгемоглобин животных имеет более широкий диапазон спектров поглощения, что выражается в наличии интервалов долин волн со сходной оптической плотностью.

Список использованной литературы:

1.Павленко, Ю.Г.Физика /Ю.Г. Павленко. -М.:Джангар,2001

2. Березов, Т.Т. Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

3.Элементарный учебник физики /Под ред Г.С. Ландберга.-М.:Наука, 1966.4.Рубина, А.Б. Биофизика /А.Б. Рубина.-М.: Высшая школа, 1987.