Качественная реакция на гемоглобин

К гемпротеидам относят гемоглобин, миоглобин, цитохромы и ферменты – каталазу и пероксидазу. Они состоят из белковой части и гема, представляющего собой тетрапиррольное соединение, связанное с атомом железа (II).

При действии на гемоглобин концентрированной уксусной кислоты в присутствии NaCl гем переходит в гемин, в котором железо трехвалентно и его третья валентность связана с хлором. При действии на гемоглобин щелочей гем переходит в гематин, в котором атом железа также трехвалентен, и третья его валентность связана с гидроксильной группой.

Гем, входящий в гемоглобин, ускоряет реакцию окисления субстратов (S·H2) пероксидом водорода, т.е. действует подобно ферменту пероксидазе: S·H2 + H2O2 – S + 2H2O. Это объясняется сходством строения простетических групп гемоглобина и пероксидазы. Однако в отличие от фермента гемоглобин сохраняет каталитические свойства при кипячении и действии сильных кислот, которые вызывают денатурацию белка.

Если в исследуемом материале содержится кровь, то ее присутствие можно обнаружить по способности геминовой группы катализировать окисление подходящих субстратов (бензидин, гвояковая смола) пероксидом водорода.

Реактивы. Пероксид водорода, 3%-ный свежеприготовленный раствор; бензидин, 5%-ный свежеприготовленный раствор в ледяной уксусной кислоте; гваяковая смоляная кислота, 1%-ный раствор на 95%-ном этиловом спирте, свежеприготовленный; азотная кислота, конц.; соляная кислота, не содержащая железа, 10%-ный раствор; гексацианоферрат (II) калия, 2,5%-ный раствор; роданид аммония, 1%-ный раствор; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив*; ацетон, подкисленный соляной кислотой (3 мл 2 М раствора HCl на 1 л ацетона, рН≈2), охлажденный в холодильнике.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги шириной 1 см; глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 и 10 мл; штатив; простые и центрифужные пробирки; водяная и песчаная бани; центрифуга с центрифужными весами; тигель фарфоровый и тигельные щипцы.

Материал.

1. Цельная кровь, разведенная в 5000 раз дистиллированной водой.

2. Кровь дефибринированная.

3. Гемоглобин кристаллический, 1%-ный водный раствор.

а. Бензидиновая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления бензидина в дифенохинондиимин пероксидом водорода

Дифенохинондиимин конденсируется с молекулой неокисленного бензидина с образованием окрашенного комплекса сине-зеленого цвета.

В пробирку наливают 1 мл цельной крови, разведенной в 5000 раз, кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают и добавляют по 2 капли раствора бензидина и пероксида водорода. Отмечают появление окрашивания.

б. Гваяковая проба на геминовую группу гемоглобина. Метод основан на способности геминовой группы гемоглобина катализировать реакцию окисления гваяковой смоляной кислоты пероксидом водорода до ее озонида, окрашенного в синий цвет.

Ход определения. В пробирку вносят несколько капель цельной крови (разведенной в 5000 раз) и кипятят ее в течение 1 мин на водяной бане. После охлаждения приливают к пробе 1-2 капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и 3 капли раствора пероксида водорода. Отмечают развитие окрашивания.

в. Проба с гексацианоферратом (II) калия и роданидом аммония на железо гемоглобина. Метод основан на способности железа, входящего в гемоглобин, образовывать с гексацианоферратом (II) калия в присутствии соляной кислоты сине-зеленое комплексное соединение – берлинскую лазурь:

4FeCl3 + 3K4[Fe(CN)6] → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ,

гексацианоферрат (II) берлинская

калия лазурь

а с роданидами – роданид железа розового или красного цвета:

FeCl3 + 3NH4CNS → Fe(CNS)3 + 3KCl

роданид роданид

аммония железа

Ход определения. Несколько капель дефибринированной крови помещают в фарфоровую чашечку (тигель) и выпаривают досуха на песчаной бане. Сухой остаток озоляют, добавляют 2-3 капли концентрированной азотной кислоты и продолжают нагревание (под тягой). При этом железо гемоглобина переходит в состав золы.

Сухой остаток переносят в пробирку, добавляют 10 капель раствора соляной кислоты до растворения золы. Разливают содержимое примерно поровну в две пробирки. В одну из них добавляют 2 капли раствора гексацианоферрата (II) калия. Наблюдают за появлением характерного окрашивания. Во вторую пробирку приливают 2 капли раствора роданида аммония и отмечают развитие специфического окрашивания.

г. Разделение гемоглобина на гем и глобин. Метод основан на способности ацетона, подкисленного соляной кислотой, разрывать связи между гемом и глобином, причем отщепившийся гем растворяется в ацетоне, а глобин выпадает в осадок.

Ход определения. В пробирку наливают 10 мл подкисленного ацетона и медленно добавляют 10 капель раствора гемоглобина. Наблюдают появление беловатой взвеси (глобин), которая постепенно оседает. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, переливают в центрифужные пробирки и центрифугирую при 1500 об/мин в течение 5 мин.

После центрифугирования в верхний слой (ацетоновый) осторожно опускают две полоски фильтровальной бумаги и проделывают реакции на наличие геминовой группировки. Для этого на одну полоску наносят по капле бензидина и раствора пероксида водорода (бензидиновая проба), на вторую –по две капли спиртового раствора гваяковой смоляной кислоты и раствора пероксида водорода (гваяковая проба). Отмечают постепенное появление характерного окрашивания на обеих полосках бумаги.

Верхний слой жидкости осторожно сливают, а к оставшемуся осадку добавляют 1 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия. Перемешивают содержимое и добавляют 10 капель биуретового реактива. Наблюдают появление характерного окрашивания.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

В выводах указать на возможность обнаружения гемоглобина в исследуемом материале с помощью проделанных качественных реакций и разделения его компонентов действием кислых растворов ацетона; отметить значение реакций для практики.

Практическое значение работы. Основная часть гемпротеидов крови находится в виде гемоглобина эритроцитов. В сыворотке или плазме крови содержится лишь незначительное количество гемпротеидов, появляющихся при значительном распаде эритроцитов (гемолизе). В сыворотке крови железо находится в виде ферротрансферина, являющегося сложным белком (металлопротеидом), который переносит железо между тканями и органами.

Качественные реакции на простетические группы протеидов позволяют выявить структурные компоненты: геминовую группировку и входящее в состав гема железо. Для обнаружения следов крови очень чувствительные бензидиновая и гваяковые пробы используются в клинике и судебно-медицинских исследованиях.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:

Соседние файлы в папке Метод 2008

• #
• #
• #

Клиническое значение определения гемоглобина

У взрослого человека норма концентрации Hb зависит от пола:

• женщины 11-14г/% или 110-140 г/л;
• мужчины 12-16 г/% или 120-160 г/л.

Для мужчин норма более завышена, так как они имеют большую мышечную массу, по сравнению с женщинами.

Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

• сниженная концентрация эритроцитов в следствии железодефицитной, серповидно-клеточной анемии;
• недостаточное количество веществ, которые влияют на продукцию эритроцитов (фолиевая кислота, витамин B12);
• заболевание красного костного мозга.

Повышенная концентрация Hb наблюдается при следующих состояниях и заболеваниях:

• повышенная продукция эритроцитов при заболевании красного костного мозга, злокачественных новообразованиях;
• компенсаторное повышение количества эритроцитов вследствие сердечно-сосудистых и легочных заболеваний;
• снижение количества плазмы крови вследствие чего число форменных элементов повышается в 1 л биологической жидкости.

Гемоглобин появляется в эритроцитах после утраты ядра и приобретении зрелости клетки. Местом утилизации красных кровяных клеток и Hb является селезенка. Жизненный цикл 1 клетки совместно составляет 120 дней. После гибели в кровь выделяется железо, которое поставляется в красный костный мозг. С помощью этого элемента продуцируются новые красные кровяные тельца.

Методы измерения гемоглобина в крови

Существуют следующие методы анализа гемоглобина в биологической жидкости:

• гемиглобинцианидный;
• гемихромный;
• Сали;
• аммиачный;

После использования соответствующей методики чаще всего применяют полуавтоматический анализатор, который измеряет спектр длины волны молекулы Hb.

Подсчет показателей осуществляется не только в крови, но и в моче, так как в мочевыделительной системе возможны небольшие или значительные кровотечения.

Полуавтоматический гематологический анализатор полностью исключают реставрации врачебные ошибки в отчете необходимого значения. Но прибор не сможет увидеть и распознать нарушение различных параметров.

Ручной подсчет основывается на применении реактива и биологической жидкости. Метод не подсчитывает число клеток, а определяется их присутствие или отсутствие. Подходит для мочи

Унифицированные методы определения гемоглобина

Унифицированная методика – способы измерения показателей, применяемые в большинстве лаборатории. Являются точными, быстрыми, практичными. Для Hb это гемицианидный метод с фотоколориметрическим подсчетом. Позволяет выявить точное количество показателя с помощью подсчета длины волны на специализированном полуавтоматическом приборе.

Второй унифицированной методикой является гимехромный способ. Его принцип тот же, но используются более качественные реактивы, которые не приносят вреда здоровью врачей.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина в крови

У гемоглобина имеется множество форм, поэтому рассчитать длину его волны очень сложно. Для упрощения подсчета применяют специализированные химические вещества, которые переводит его в метгемоглобин.

Для получения точных результатов необходимо использовать трансформирующий раствор, специализированные измерительные пробирки, фотоэлектроколориметр. Hb имеет длину волны 540 м. Именно в таком пределе прибор подсчитывает заданный показатель.

Полученные данные подставляют в формулу, которая переводит общее количество показатели в граммы на литры (г/л).

Важно! На данный момент метод определения концентрации гемоглобина в крови используется редко, так как применяемые реактивы опасны для жизни и здоровья в врачей-лаборантов. При нарушении правил приготовления могут возникнуть ожоги кожных покровов и слизистых оболочек.

Читай подробно о гемиглобинцианидном методе в отдельной статье!

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови

С помощью методики Hb переводится в циангемоглобин с помощью реактивов, которые полностью безопасны для человека. Для этого используют цианистые соединения (натрий додецилсульфат, лаурилсульфат).

Образуется гемихром, который подсчитывается при длине волны 540 нм. Полученные данные подставляют в формулу для перевода показателя в г/л.

Подробная статья о гемихромном методе определения гемоглобина.

Цианидный метод исследования гемоглобина в крови

Для проведения анализа используют капиллярную и венозную кровь. В биологическую жидкость человека добавляют трансформирующий раствор. С помощью него происходит преобразование всех форм Hb в метгемоглобин.

В пробирку наливают 5 мл реагента и 20 мкл биологической жидкости. Выжидают 10 минут, пока произойдет реакция. Полученную жидкость заливают в специальную кювету, фотоэлектроколориметр пропускает через нее лучи, подсчитывает элементы в области длины волны, равной 543 нм. Содержание Hb рассчитывается по формуле с помощью полученных показателей.

Метод Сали для определения гемоглобина в крови

Определение количества гемоглобина по методу Сали редко применяется в клинических учреждениях, так как существуют более совершенные способы.

Получают биологическую жидкость человека, в которую добавляют хлористоводородная кислоту. Раствор тщательно перемешивают. Это позволяет Hb перейти в другую форму – солянокислый гематин. Добавляют дистиллированную воду до тех пор, пока окрашивание не будет идентичным с контрольной пробиркой (коричневый цвет).

На нижнем мениске пробирки будет стоять цифра, которая указывает на содержание показателя в 100 г крови. Для вычисления концентрации в 1 литре, показатели умножают на 10. Процентное содержание Hb вычисляется с помощью пропорции:

16,7%=100

• А%=Х
• Х=А×100/16,7
• Х – определяемый показатель,
• А – полученное число гемоглобина с помощью гемометра,
• 16,7 – процентное количество гемоглобина в контрольной пробе.

Метод спектрального анализа для измерения гемоглобина

Наиболее точным методом определения гемоглобина является использование спектрофотометра. Он определяет только 1 из форм гемоглобина, улавливая длину его волны. В крови человека существуют различные формы Hb:

• Оксигемоглобин;
• Дезоксигемоглобин;
• Карбоксигемоглобин;
• Метгемоглобин.

Для исследования с помощью спектрофотометра необходим перевод показателей только в 1 из форм. Для этого применяют различные реактивы. Показатель окрашивается определенным цветом (красный, зеленый). Его длину волны улавливает прибор, подсчитывает все элементы в заданной траектории.

Аммиачный метод определения гемоглобина

Аммиачный метод количественного определения гемоглобина соответствует предыдущим способам. Разницу составляет использование аммиака в концентрации 0,04%. Проба должна настояться, чтобы произошла реакция перехода всех форм Hb в одну. Ее рассчитывают с помощью полуавтоматического анализатора в виде спектрофотометра. Раствор помещают в кювету, устанавливают в прибор. Рассчитывают показатель на длине волны 543 нанометров.

Методы определения гемоглобина в моче

Существует 4 разновидности исследования мочи. Каждая из них отличается применяемыми реактивами. Для исследования собирают только свежую порцию урины. Если она настоится, Hb превратиться в медгемоглобин, Поэтому реакция будет невозможна. Урину подготавливают. Для этого к ней добавляет 2 мл уксусной кислоты и 5 мл диэтилового эфира.

• Реакция с гваяковой кислотой. Разводят щепотку кислоты, добавляют 3 мл этанола 96%. Добавляют 8-10 капель получившейся жидкости к 8-10 каплям разведенной урины. Если Hb присутствует в образце, он окрашивается в синий цвет.
• Реакция с амидопирином. К 2-3 мл разведенной урины добавляют 10 капель раствора амидопирина и 10 капель 3% перекиси водорода. Если Hb присутствует, урина окрашивается в фиолетовый цвет.
• Реакция с бензидином. В пробирку добавляют 6 капель бензидина, 6 капель 3% перекиси водорода,4 капли чистой урины. Если Hb присутствует, получившаяся жидкость окрашивается в зеленый цвет.
• Использование тест-полосок, таблеток. Они содержат специализированные реактивы в готовом виде. Полоски опускают в мочу, достают, оценивают цветовую шкалу. Таблетки полностью растворяют в биологической жидкости человека. Индикаторная шкала подписана на упаковке.

Какой метод определения гемоглобина наиболее точный?

Наиболее точным методом определения показателя считается фотоколориметрический с использованием гемихромного разведения. С помощью него снижается риск врачебной ошибки. Прибор автоматически подсчитывает показатель. Здесь важно правильно подготовить приборы, пробирки, кюветы, настроить аппарат. Методика безопасна для лаборанта.

В определении Hb в моче наиболее информативным является использование тест-полосок. Здесь полностью исключается риск неправильного разведения реактивов. 

Определение гемоглобина является важным информативным тестом. Можно определить кровотечение в мочевыводящих путях, состояние сердечно-сосудистой и легочной системы. С помощью методов вовремя выявляются различные виды анемии при низких концентрациях гемоглобина. После получения данных рекомендуется обратиться к лечащему врачу. Он расшифрует полученный результат, выявит нормы и отклонения, назначит лечение. 

Узнай о методах определения гликозилированного гемоглобина в крови!

Екатерина Беликова, врач лабораторной диагностики, специально для Mirmam.pro

Полезное видео