Норма каротина в крови у овец

Цель занятия. Научиться определять концентрацию каротина и витаминов А, E, С; приобрести навыки диагностической оценки полученных результатов.

Объекты исследования и оборудование. Сыворотка (плазма) крови.

Спектрофотометр, фотоэлектроколориметр, пробирки из стекла «пирекс» с пришлифованными пробками, центрифужные пробирки, водяная баня, ультрафиолетовая лампа ПРК-4, вентилятор настольный, центрифуга, мерные цилиндры вместимостью 250 мл, мерные колбы вместимостью 50 и 100 мл, пипетки 0,1 и 2 мл, стеклянные палочки.

Реактивы для определения каротина: 95%-й этиловый спирт, пет- ролейный эфир или бензин марки В-70, стандартный раствор бихромата калия (360 мг бихромата калия, дистиллированная вода до 500 мл), рабочий раствор бихромата калия (5 мл стандартного раствора бихромата калия и 5 мл дистиллированной воды).

Реактивы для определения витамина А: 96%-й этиловый спирт; 11 н. раствор гидроксида калия (617,21 г гидроксида калия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1000 мл); 1 н. раствор гидроксида калия в 96%-м этиловом спирте (к 1 объему 11 н. раствора гидроксида калия добавить 10 объемов этилового пирта; раствор готовят в день исследования), ксилоло-октановая смесь (1:1) (готовят в день исследования).

Реактивы для определения витамина Е: 96%-й этиловый спирт, гексан, хлороформ, 2%-й раствор аа’-дипиридила в этиловом спирте, 2%-й раствор хлорида железа (III) в этиловом спирте.

Реактивы для определения витамина С: 5%-й раствор трихлоруксус- ной кислоты (5 г кислоты растворяют дистиллированной водой до 100 мл); 3%-й раствор хлорида железа (III) (1,5 г соли растворяют в 50 мл дистиллированной воды). Раствор хранится 3 сут. 1 %-й раствор аа’-дипиридила (к 0,5 г препарата добавляют 4 мл этилового спирта, а затем в мерной колбе вместимостью 50 мл доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки); 85%-й раствор ортофосфорной кислоты; аскорбиновая кислота (х. ч.).

Определение содержания каротина (по В.Ф. Коромыслову и Л.А. Кудрявцевой). В пробирку вносят 1 мл сыворотки крови и 3 мл 95%-го этилового спирта, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Добавляют 6 мл петролейного эфира (или бензина), энергично встряхивают не менее 2 мин и осторожно приливают по стенке пробирки 0,5 мл дистиллированной воды. Выдерживают при комнатной температуре до четкого разделения органической и водяной фаз. Затем осторожно сливают 4,5—5 мл экстракта каротина и переносят в кювету.

Колориметрируют в кюветах с рабочей гранью толщиной 10 мм при синем светофильтре против петролейного эфира (бензина). Одновременно колориметрируют рабочий раствор бихромата калия.

Показатель рассчитывают по формуле

где Хк — количество каротина, мг/100 мл; А — оптическая плотность пробы; Б — оптическая плотность рабочего раствора; 1,248 — коэффициент для пересчета каротина в мг/100 мл.

Чтобы определить содержание каротина в 1 л, умножают полученный результат в мг/100 мл на 10 или используют формулу

где Хк — количество каротина, мг/л; 12,48 — коэффициент для пересчета каротина в мг/л.

Содержание каротина в сыворотке крови здоровых животных представлено ниже.

Уменьшение содержания каротина в крови называется гипокаро- тинемией. Недостаток каротина и витамина А ослабляет резистентность организма, способствует развитию у молодняка диспепсии, бронхопневмонии, кератоконъюнктивитов, отставанию в росте; у коров вызывает снижение продуктивности, служит причиной абортов, задержания последа, субинволюции матки, нарушения половых циклов; у быков-производителей — нарушения сперматогенеза; у свиней — возникновения уродств у поросят.

Определение содержания витамина А (ретинола). В центрифужную пробирку вносят 1 мл плазмы крови и добавляют 1 н. спиртовой раствор гидроксида калия, перемешивают стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза на водяную баню при температуре 60 °С на 20 мин. Пробу охлаждают в воде со льдом в течение 5—10 мин и добавляют 3 мл ксилоло-окгановой смеси. Пробирку со смесью сильно встряхивают и дают постоять, после чего центрифугируют 5 мин при 1500 мин’1.

Надосадочную жидкость переносят пипеткой в кварцевую кювету и фотометрируют при длине волны 450 нм (определяют оптическую плотность каротина) с использованием лампы накаливания.

Для определения витамина А пробы фотометрируют при длине волны 328 нм до и после ультрафиолетового облучения с использованием дейтериевой лампы и светофильтра УФС-2 и вычисляют разницу оптической плотности. Пробы облучают в закрытых пробирках из стекла «пирекс» лампой ПРК-4 на расстоянии 15—19 см в течение 1 ч. Охлаждают с помощью настольного вентилятора.

Содержание витамина А и каротина рассчитывают по формулам

где X — содержание витамина А, мкг/100 мл; Е]— разница оптической плотности проб до и после облучения при 328 нм; у — содержание каротина, мкг/100 мл; Е-, — оптическая плотность пробы при 460 нм; 3 — количество ксилоло-октановой смеси, мл.

Содержание витамина А в сыворотке крови у здоровых животных представлено ниже.

Примечание. Коэффициент пересчета в мкмоль/л равен 0,035.

Отсутствие витамина А носит название авитаминоз Л, уменьшение содержания — гиповитаминоз Л.

При недостатке витамина А в организме происходит ороговение (гиперкератоз) эпителиальных клеток кожи, конъюнктивы, желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей и мочеполовых органов. Снижение защитной функции и секреции слизистых оболочек способствует развитию конъюнктивитов, ринитов, бронхитов, кишечных заболеваний, болезней органов мочевыводящей системы. В связи с метаплазией эпителия половых органов у самок отмечают бесплодие, аборты, у самцов нарушается спермиогенез.

Вследствие нарушения функции слезных желез возникают сухость роговицы, ксерофтальмия, кератоконъюнктивит. Теряется способность видеть предметы в сумерках. У молодняка наблюдают задержку роста, уменьшение прироста массы тела.

Определение содержания витамина Е (токоферола). В центрифужную пробирку вносят сначала 1 мл сыворотки крови, затем 1 мл этилового спирта и хорошо перемешивают стеклянной палочкой, после чего добавляют 3 мл гексана. Пробирку энергично встряхивают несколько раз и центрифугируют 5 мин при 3000 мин’1.

После центрифугирования отбирают весь верхний слой и коло- риметрируют при длине волны 460 нм (синий светофильтр № 4) в кювете с рабочей гранью толщиной 5 мм. В контрольную кювету наливают гексан.

После колориметрирования от каждой пробы отбирают 2 мл цен- трифугата в чистые пробирки и выпаривают в токе азота на водяной бане при 60 °С.

К сухому остатку добавляют 0,2 мл хлороформа (для разведения липидного остатка), 2 мл этилового спирта, 0,2 мл аа’-дипиридола, 0,2 мл хлорида железа (III), хорошо встряхивают и переносят в кювету. В контрольную кювету вносят смесь реактивов: 0,2 мл хлороформа, 2 мл этилового спирта, 0,2 мл аа’-дипиридола, 0,2 мл хлорида железа (III) и колориметрируют при длине волны 520 нм (зеленый светофильтр № 6).

Содержание витамина Е рассчитывают по формуле

где X — концентрация витамина Е, мг/100мл; Сф520 — оптическая плотность токоферола; Сф460 — оптическая плотность каротина.

Содержание витамина Е в сыворотке крови у здоровых животных привведено ниже.

Примечание. Коэффициент пересчета в мкмоль/л равен 23.

Вид животного Содержание витамина Е,

мг/100мл (мкмоль/л)

Крупный рогатый скот 0,13—1,5 (3—34,5)

Овцы 0,06-0,5 (1,38-11,5)

Лошади 0,2-1,1(4,6-25,3)

Свиньи 0,1—1,5 (2,3—34,5)

Собаки 0,09-1,2(2-27,6)

Снижение содержания витамина Е — гиповитаминоз Е — приводит к дистрофическим изменениям эпителия половых желез, скелетных мышц, миокарда и др. У самцов угасают половые рефлексы, нарушается спермиогенез, у самок наступает бесплодие из-за гибели эмбрионов. При длительном недостатке токоферола начинаются распад мышечных волокон, некроз печени, повышается проницаемость сосудов и появляются геморрагии, возникает анемия.

Расстройство межуточного обмена и образование токсичных веществ в организме приводит к изменению функции эндокринной системы, головного мозга (судороги, параличи); угнетается синтез иммуноглобулинов за счет снижения числа Т-хелперов.

Определение содержания витамина С (аскорбиновой кислоты). К 2 мл сыворотки (плазмы) добавляют 0,3 мл охлажденного 40%-го раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой и выдерживают 10 мин на холоде (в воде со льдом) для полной денатурации белков. Центрифугируют при 2000 мин”1 20 мин. К 1 мл надо- садочной жидкости прибавляют 0,5 мл бидистиллированной воды, 0,1 мл 85%-й ортофосфорной кислоты, 0,8 мл 1%-го раствора аа’- дипиридила и 0,1 мл 3%-го раствора хлорида железа (ІН). Содержимое пробирки после добавления каждого реактива тщательно перемешивают и затем оставляют на 30 мин для проявления окраски (окраска стабильна в течение 1 сут). Через 30 мин пробы центрифугируют 5 мин при 2000 мин’1 и колориметрируют при длине волны 525 нм (желтый светофильтр) в кюветах с рабочей гранью толщиной 5 мм против контрольной пробы с дистиллированной водой. Содержание витамина С рассчитывают по калибровочному графику. Чтобы его построить, к 33,3 г аскорбиновой кислоты добавляют 100 мл 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты. 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 5%-м раствором трихлоруксусной кислоты. (Стандартные растворы аскорбиновой кислоты нестойки, их готовят перед исследованием.) В семь мерных колбочек вместимостью 100 мл вносят последовательно 4,6, 8,10,20, 30,40 мл стандартного раствора витамина С и доводят до метки дистиллированной водой, что будет соответствовать 0,13; 0,2; 0,26; 0,333; 0,666; 0,999; 1,332 мг витамина С.

Из каждой колбочки по 1,5 мл раствора переносят в центрифужные пробирки и прибавляют по 0,1 мл 85%-й ортофосфорной кислоты, 0,8 мл 1%-го раствора аа’-дипиридила и 0,1 мл 3%-го раствора хлорида железа (III), перемешивают и оставляют на 30 мин для проявления окраски, после чего пробы центрифугируют 5 мин при 2000 мин’1 и колориметрируют. Полученные результаты изображают графически на миллиметровой бумаге.

Количество витамина С в сыворотке крови здоровых животных представлено ниже.

Примечание. Коэффициент пересчета в мкмоль/л равен 56,776.

При недостатке аскорбиновой кислоты в организме развивается гиповитаминоз С, при этом нарушается целостность опорных тканей, замедляются регенеративные процессы, стенки кровеносных сосудов приобретают повышенную проницаемость, что приводит к развитию геморрагического диатеза. С возрастанием недостатка витамина угнетаются гемопоэз, фагоцитарная активность лейкоцитов, уменьшается синтез стероидных гормонов и иммуноглобулинов, снижается сопротивляемость организма инфекционным, паразитарным и незаразным заболеваниям.